Cancer Y Nano Chips

Nano-bio-chips multiplexados de alto rendimiento para la detección de proteínas: determinación de biomarcadores de cáncer en suero y saliva con etiquetas bioconjugadas de puntos cuánticos

Abstract:

La integración de los semiconductores de nanoparticulas de puntos cuánticos en un biosensor modular de microfluidos para la cuantificación multiplexada de tres importantes marcadores de cáncer, antígenos carcinoembrionicos (cea), antígeno de cáncer 125 (CA125), y Her-2/Neu (C-erb-2) fue lograda. La funcionalidad del procesamiento integrado de muestras, modalidades de captura y detección de analitos fue demostrada usando especímenes de saliva y suero. Aquí los nano-bio-chips que emplearon una señal de transducción fluorescente con puntos cuánticos etiquetados detectando anticuerpos donde fueron usados en combinación con captura de antígenos por un arreglo de cordones de micro poros agarosos soportado dentro de un conjunto de microfluidos con el fin de completar el inmunoensayo de tipo sándwich. La utilización de pruebas de puntos cuánticos en este formato miniatura en este formato de biosensor miniatura resulto en la amplificación de 30 veces de una señal en relación con el del estándar de fluoroforos así como proporcionando una reducción en los límites de detección observados por cerca de 2 órdenes de magnitud (0.02 ng/mL CEA; 0.11 pM CEA) relativa a la enzima ligada (ELISA). Los estudios de validación de los ensayos indican que las medidas por medio del sistema de los nano-bio-chips se correlacionan con los métodos estándar en R^2=0.94 y R^2=95 para saliva y suero respectivamente. Este sistema integrado de ensayos de nano-bio-chips junto con la próxima generación de fluoroforos, promete ser una sensible, herramienta multiplexada para importantes diagnósticos y pronósticos.

Introducción

• Los biomarcadores de proteínas son prometedores en el diagnostico y tratamiento de cáncer incipiente, en su desarrollo mediante la proyección y escenificación, evaluación de la metástasis y determinación de la respuesta a la intervención farmacológica.

• Pruebas de sangre oculta (¿)

• Prueba de papanicolau

• Antígeno prostático (Psa)

• Monitoreo de cáncer de colon a través de la respuesta al tratamiento vía antígeno carcinoembrionico

• Cáncer de ovario vía antígeno 125

• Las etapas iniciales del cáncer frecuentemente requieren el uso de 4 o mas biomarcadores para identificar puntualmente los riesgos individuales con la confianza adecuada y los actuales métodos usados basados en ELISA no son fácilmente multiplexables,

• Debido a los limitantes de costo y tecnología, los sistemas integrados de microfluidos se han convertido en una opción atractiva para centralizar el paradigma del laboratorio.

• LOC, lab on a chip, estos sistemas ofrecen opciones como tamaños de muestras pequeños, bajo costo y cortos tiempos de análisis.

• Los estudios POC(point of care) ofrecen a los médicos la posibilidad de diagnósticos tempranos que usualmente son estudios a largo plazo

• Se dice q la saliva es un espejo del cuerpo y contiene biomarcadores y componentes del suero proteoma q ofrece valiosa información de los sistemas corporales.

• La ventaja de trabajar con la saliva es que es fácil recolectar en muestras de diferentes tamaños sin tener que hacer extensos procedimientos de recolección.

• Una matriz de muestra de saliva es más variable y heterogénea que el suero, y contiene altos niveles de mucinas y enzimas proteolicas.

• El uso de avanzadas técnicas de detección como las nano partículas semiconductoras de puntos cuánticos fluoroforos son prometedores para ayudar a superar algunos de los cambio inherentes a usar saliva en dispositivos POC.

• En medio de este esfuerzo de desarrollar nuevos sistemas para la temprana detección de enfermedades neoplasicas, los trabajos recientes en el laboratorio han desarrollado dispositivos miniatura llamados nano-bio-chips (NBC), sensores sensibles para analizar el POC.

• Los sensores NBC emplean un una red nano de tamaño ajustable dentro de microesferas agarosas y una señal de transducción que surge a partir de nanoparticulas fluorescentes (nano) para aislar y cuantificar analitos biológicos de las matrices complejas dentro de un sistema cerrado miniaturizado.

• En este estudio se describe la incorporación de puntos cuánticos como la detección de elementos en sistemas NBC para la medición de tres biomarcadores de cáncer: CEA, CA125, y her-12/neu.

Materiales y métodos

Inmunoreactivos

• Solución salina tamponada con fosfato (pbs) de termo científico con PH 7,4, usado como tampón de lavado y el diluyente de los patrones de proteínas, se prepara diariamente y es filtrado con 0,2um de membrana filtro.

• Para mantener la estabilidad de la proteína y reducir uniones no especificas, se añadió un 1% de albumina de suero bovino de sigma aldrich por peso al PBS.

• Las nano partículas de puntos cuánticos con emisiones máximas de 565nm y 655nm fueron compradas a Invitrogen, como eran reactivos para un succinimidil 4-(N-maleimidometil) ciclohexanocarboxilato (smcc) facilito la conjugación de anticuerpos.

• Absorbencia y la espectroscopia de fluorescencia se realizaron en un Plus SpectrraMax y GeminiXs SpectraMax, espectrofotómetro de microvaloracion respectivamente, ambos de dispositivos moleculares.

Interpretación de datos

• Las microfotografías fueron capturadas tanto antes como después de la detección de introducción conjugada para permitir la corrección del fondo de las imágenes.

• Se guardaron como archivos de 12bits de colores TIFF y fueron analizados a través del software NIH Imagej con la intensidad de la señal del cordón de fluorescencia correlacionado con la concentración de analito en la muestra.

• Macros automáticos de deconvolucion convirtieron la imagen a una escala de grises de 8bits con áreas de interés (AOIs) dibujadas para los correspondientes cordones.

• Las curvas de intensidad frente a concentración de calibración fueron construidas con el análisis de regresión de mejor ajuste para la determinación de concentración de la muestra desconocida.

Discusión y resultados

• El objetivo principal es caracterizar los análisis de los biomarcadores de cáncer, empleando QD’s como medio de detención en los NBC.

• La plataforma basada en puntos cuánticos incluye todos los componentes fundamentales del inmunoensayo sandwich con la inclusión de “perlas” de agarosa como soporte sólido de fase.

• Diversos clones de

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