Caracterización Del Gen De La Proteína De La Cápside De Dos Aislamientos Del Virus Del Mosaico Del Pepino (CMV), Obtenido De Plátano Y Banano

Artículo Científico

Autores: Helena Reichel, Leonardo Mariño, Jean Kummert, Silvio Bel alcázar, Javier Narváez

Caracterización del Gen de la Proteína de la Cápside de Dos Aislamientos del Virus del Mosaico del Pepino (CMV), obtenido de Plátano y Banano

Abstract

Title: Characterization Of The Coat Protein Gene Of Two Cucumber Mosaic Virus (CMC) Isolates From Plantain And Banana (Musa Spp)

The final objective of this study is to genetically engineer cucumber mosaic virus (CMV) resistance in edible Musa spp, in Colombia, by means of expressing the CMV coat protein gene in transgenic plants. This strategy has been successfully employed in other crops. CMV was serologically detected in leaves of commercially grown bananas (cv. Gros Michel )and plantains (cv Dominico-Harton )showing mosaic symptoms. CMV was partially purified from infected tissue of Nicotiana tabacum. Transmission electron microscopy examination showed the presence of viral isometric particles of approximately 30nm in diameter. The molecular weight of the coat protein subunit was approximately 28 kDa as determined by SDS-PAGE Analysis of double – stranded RNA (dsRNA) indicated that the isolations present in both varieties had similar dsRNA profiles, characteristic of CMV, cDNA was reverse transcribed using viral dsRNA as the template, and the coat protein genes (CPG) of the two CMV isolates were amplified by the polymerase chain reaction (PCR). The amplified products of approximately 890 bp, containing the CPG, were cloned into the plasmid vector Bluescript KS (+/-), Based on the pattern obtained from the digestion of the amplified CP genes with Msp 1 and DNA sequencing data, the two CMV isolates were classified into the serotype subgroup I (typified by isolate DTL). Computer analysis of DNA sequences of the CP genes derived from both CMV isolates showed a 99% homology between them at the nucleotide and amino acid level as well as a high level of conservation with other members of the CMV subgroup I. The CPG of CMV are now being cloned into plant transformation vectors for their genetic engineering into banana and plantain commercial cultivars.

Key Words: CMV, Viral Genes, Molecular Virology, Transgenic Plants.

Resumen

El presente estudio se adelantó dentro de un proyecto de investigación para obtención de plantas resistentes al virus del mosaico del pepino (CMV), mediante la transformación y expresión del gen de la proteína de la cápside de CMV en plantas transfénicas de variedades comerciales de plátano y banano (Musa spp). Se trata de una estrategia reciente que ha sido utilizada con éxito en varios cultivos comerciales. El CMV fue detectado serolígamente (DAS-ELISA) en hojas de plátano cv. Dominico Hartón y de banano cv: Gross Michel que presentaban síntomas de mosaico. El virus se purificó parcialmente a partir de hojas infectadas de Nicotiana tabacum y con la ayuda del microscopio electrónico de transmisión, se identificaron partículas isométricas de aproximadamente 30 nm de diámetro. El peso molecular de la proteína de la cápside de genes desnaturalizados de poliacrilamida (SDS-PAGE) fue de 28 kDa. El patrón electroforético del RNA viral del doble cadena (dcRNA) fue similar para los dos aislamientos de CMV obtenidos de plátano y banano. Utilizando la dcRNA como patrón , se sintetizó cADN por transcripción reversa y , a partir de éste, se amplificaron por PCR los genes de la proteína de la cápside (GPC) de ambos aislamientos. Los productos de la amplificación de aproximadamente 890 pares de bases (pb), que contenían el GPC, se clonaron en el plásmido vector Bluescript KS (+/-). El análisis de restricción con endonucleasas y la secuenciación del GPC de ambos aislamientos, indicó que éstos pertenecen al subgrupo I (tipificado por el aislamiento DTL). El análisis de la secuencia nucleotídica y de aminoácidos de ambos genes, indicó una homología del 99% y un alto grado de conservación con otros miembros del subgrupo I de CMV , El GPC se está clonando en plásmidos vectores para su transformación en variedades comerciales de plátano y banano en Colombia.

Palabras Claves: Mosaico Del Banano, CMV, Proteína De La Cápside, Genes Virales, Virología Molecular, Plantas Transgénicas.

Introducción

El Banano y el platáno (Musa spp), son alimentos básicos de la canasta familiar de los colombianos y su exportación genera importantes divisas para la economía nacional. Colombia es el tercer productor mundial del banano con un área cultivada de 30.000 ha. El plátano es cultivado en una extensión aproximada de 350.000 ha, con una producción que supera los 2.5 millones de toneladas anuales, destinadas en un 86% al consumo interno y el resto a la exportación. El sistema de producción predominante es de tipo minifundista, en el que aproximadamente 154.000 productores poseen cultivos con menos de 5ha y 13.000 medianos productores poseen entre 5 y 20 ha, éstas últimas dedicadas principalmente a la exportación (Belalcázar, 1991).

Las enfermedades causadas por hongos, bacterias y virus constituyen uno de los mayores limitantes de la producción de plátano y banano (Belalcázar, 1991). En los últimos años, el virus del mosaico del pepino (CMV) (Francki et al.,1985), agente causal de la enfermedad mosaica del banano (Yot-Dauthy y Bové, 1966; Jones 1994), se viene presentando con mayor incidencia en plantaciones de éstos cultivos en la zona cafetera, donde se produce cerca de 70% del plátano del país (Belalcázar, 1991; Castaño et al .,1994). Las plantas infectadas por CMV son más pequeñas, presentan síntomas de mosaico en las hojas y producen pocos frutos, de menor tamaño y con desarrollo incompleto. En caso severos, las plantas infectadas mueren (Jones,1994).

El CMV pertenece al grupo de los cucumovirus y es uno de los más diseminados en el mundo, con mas de 800 especies hospederas que incluyen plátano , banano, maíz, fríjol hortalizas, tabaco, etc. El virus puede ser transmitido a través de la semilla por medios mecánicos y por más de 60 especies de áfidos vectores (Francki et al.,1985;Jones,1994). Se ha identificado alrededor de 39 aislamientos de CMV clasificados en dos grandes serogrupos, el subgrupoI I, tipificado por el aislamiento DTL, que predomina en el trópico y en el subtrópico ; mientras que el subgrupo II, tipificado por el aislamiento ToRS, prevalece en regiones de la zona templada (Devergne y Cardín, 1973; Kearney et al., 1990).

No se conoce fuentes naturales de resistencia genética a CMV en germoplasma de Musa spp. La obtención de plantas transgénicas con resistencia a virus mediante la expresión del gen de la proteína de la cápside (GPC), es una estrategia empleada con éxito con cultivos como tabaco, tomate, papa, alfalfa, cohombro y papaya. (Powell Abel er al ., 1988; Gonsalves

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