Estructura y aislamiento de aminoácidos y proteínas

Práctica #2

Estructura y aislamiento de aminoácidos y proteínas

Universidad Autónoma de Ciudad Juárez

Objetivos:

• Al término de esta práctica el alumno será capaz de diferenciar a los aminoácidos utilizando técnicas colorimétricas más comunes para identificarlos, así como relacionar la estructura de los aminoácidos con su reactividad y sus funciones en el organismo
• El alumno deberá ser capaz de describir algunas de las técnicas de detección cualitativas de proteínas en base a los componentes de su estructura
• El alumno será capaz de describir el efecto de los solventes sobre las propiedades electroquímicas de las proteínas PM de acuerdo a las siguientes variables:

• Solubilidad de las proteínas en diferentes soluciones de sales
• Propiedades electroquímicas de las proteínas
• Efecto ácido acético sobre el punto isoeléctrico de una proteína.

Introducción:

Los aminoácidos participan en funciones celulares como la transmisión nerviosa y la biosíntesis de porfirinas. Proporcionan unidades monómero, siendo a partir de estas la formación de cadenas largas polipeptídicas de proteínas. Algunas proteínas contienen aminoácidos adicionales que surgen por modificación de un aminoácido ya presente en un péptido. La secuencia de aminoácidos determina la configuración tridimensional final de cada proteína, se pueden clasificar por su capacidad de interacción con el agua.

• Los aminoácidos apolares contienen principalmente grupos R hidrocarbonados sin cargas positivas o negativas. Interaccionan poco con el agua, lo que ayuda a mantener la estructura tridimensional de las proteínas
• Los aminoácidos polares tienen grupos funcionales capaces de formar puentes de hidrógeno, interactuando fácilmente con el agua denominándose hidrofílicos
• Los aminoácidos ácidos poseen cadenas laterales con grupos carboxilo
• Los aminoácidos básicos poseen carga positiva de pH fisiológico. Pueden formar enlaces iónicos con los aminoácidos ácidos. Su capacidad , en condiciones fisiológicas, para aceptar y donar protones como respuesta de los pequeños cambios de pH tiene un papel importante en la actividad catalítica de muchas enzimas.  

Las proteínas son un grupo diverso de macromoléculas que está directamente relacionada con las posibilidades de combinación de cada monómero de los 20 aminoácidos. Son herramientas moleculares que realizan una sorprendente variedad de funciones, además de servir como materiales estructurales en todos los organismos vivos.  

Los aminoácidos con sus grupos carboxilo, grupos amino y grupos R pueden experimentar numerosas reacciones químicas. Sin embargo, la formación de los enlaces peptídicos y de puente disulfuro son de especial interés debido a su efecto sobre la estructura proteica. Los polipéptidos son polímeros lineales formados por aminoácidos unidos por enlaces peptídicos, los cuales son enlaces amida que se forma cuando el par de electrones sin compartir el átomo de nitrógeno alfa amino de un aminoácido ataca al carbono alfa carboxilo de otro en una reaccion de sustitucion de acilo nucleófila. Los aminoácidos unidos en un polipéptido se denominan residuos de aminoácidos.

Las proteínas son moléculas extraordinariamente complejas, se han diferenciado varios niveles en la organización estructural de las proteínas. En estructura primaria, la secuencia de aminoácidos es especificada en la información genética, cada polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos específica, las interacciones entre los residuos de aminoácidos determinan la estructura tridimensional de la proteína, su función y sus relaciones con otras proteínas. la estructura secundaria, consta de varios protones repetitivos, los tipos que se observan con mayor frecuencia son la hélice-alfa y la la mina beta-plegada, las cuales se estabilizan con puentes de hidrógeno entre los grupos carbonilo y N-H del esqueleto peptídico, ciertos aminoácidos fomentan o inhiben patrones específicos de estructura secundaria, muchas proteínas fibrosas están formadas casi por completo por patrones de estructura secundaria.  Las proteínas globulares que contienen combinaciones de las estructuras secundarias hélice-alfa y lámina beta-plegada se les denomina estructura supersecundaria, las cuales pueden ser de tipo unidades beta-alfa-beta, meandro-beta, unidad alfa-alfa, barril-beta y llave griega.  La estructura terciaria señala las conformaciones tridimensionales únicas que asumen las proteínas globulares cuando se pliegan en sus estructuras nativas y se insertan los grupos prostéticos, presenta tres dominios que son mano EF, dedos de ZN y zipper de leucina. En una estructura cuaternaria, muchas proteínas, en particular las que tienen pesos moleculares elevados, están formadas por varias cadenas polipeptídicas, las subunidades en un complejo proteico pueden ser idénticas o diferentes.

Una proteína altamente purificada es esencial para el examen detallado de su propiedades físicas funcionales. El aislamiento de una proteína específica en cantidades suficientes para analizar sus propiedades plantea un formidable desafío que puede requerir la aplicación sucesiva de múltiples técnicas de purificación. Es muy común aislar y purificar proteínas para estudiar su composición, estructura y de ser posible su función. la composición de los aminoácidos, es también responsable del comportamiento de las proteínas en diferentes condiciones de pH, así al acidificar o alcalinizar una proteína, esta puede llegar a su punto isoeléctrico (alcanzar una carga neta de cero) y precipitarse.

Existen factores que afectan el estado nativo de las proteínas, sin embargo, estas pueden someterse a una purificación parcial empleando técnicas bioquímicas sencillas como la centrifugación, diálisis y cromatografía.  

Materiales y métodos:

En esta práctica se debió experimentar con cinco tipos de reacciones: La prueba de nitroprusiato (Reacción de Brand), la identificación de fenoles p-sustituidos, la prueba de ninhidrina, reacción de biuret y la determinación del punto isoeléctrico de la albúmina por adición de un ácido.

Durante esta práctica de laboratorio el material utilizado fueron:

•  Tubos de ensayo
• Gradilla
•  Pipetas de 1, 5 y 10 ml
•  Propipetas
•  Vasos de precipitado
•  Una platina caliente.

Lo primero que se debe hacer antes de comenzar con los experimentos es etiquetar el material con el que se está trabajando, con la intención de tener organizada la práctica y no mezclar sustancias en el caso de las pipetas y los tubos de ensaye.

• En la prueba de Brand preparamos 3 tubos de ensaye a los que les agregamos 2 gotas de Nitroprusiato de sodio al 5%, después les agregamos 0.5 ml de NaCN al 5% ( Cianuro de sodio), al primer tubo de ensaye (blanco) le agregamos 0.5 ml de agua, al segundo tubo (patrón) le agregamos 0.5 ml de Cisteína al 1% y por último  al tercer tubo le agregamos el aminoácido problema. En este experimento se busca una coloración rosa-roja que indica resultados positivos.
• Para la reacción de identificación de fenoles p-sustituidos preparamos 3 tubos de ensaye y les agregamos 2 gotas de Nitrosonaftol al 1%, al primer tubo de ensaye (blanco) le agregamos 1 ml de agua, al segundo tubo (patrón) le agregamos 1 ml de tirosina al 1% y al último tubo le agregamos la solución problema. Después de esto mezclamos los tubos y los calentamos en baño de ebullición durante 5 minutos, lo sacamos y dejamos enfriar, Posterior a esto agregamos 2 gotas de Ácido nítrico a todos los tubos sin mezclarlos. Por último debemos observar la aparición de un color rosa violáceo siendo este positivo para los aminoácidos que tienen un grupo fenol en su estructura.
• Después continuamos con la reacción de identificación de aminoácidos de ninhidrina. Primero preparamos nuevamente 3 tubos de ensaye a los que les agregamos 1 ml de agua destilada y 0.5 ml de ninhidrina. Al primer tubo (blanco) no se le agregara nada más, mientras que al segundo tubo (patrón) se le agrega 1 ml del aminoácido patrón. Mezclamos los reactivos dentro de cada tubo y calentamos en agua a ebullición. Sacamos los tubos inmediatamente que ocurra el cambio de color.
• Continuamos con la reacción de biuret. Para esto preparamos 5 tubos de ensaye a los que les agregamos 1 ml de biuret. Al primer tubo (blanco) le agregamos 1 ml de agua destilada, a los siguientes cuatro tubos a cada uno se le agrega 1 ml de un aminoácido que en este caso son albúmina, peptona, gelatina y tirosina. Agitamos y dejamos reposar los tubos durante 15 minutos para finalmente observar su coloración e intensidad.
• Por último experimentamos con el punto isoeléctrico de la albúmina. Para ello preparamos 10 tubos de ensaye  a los que les agregamos 1 ml de albuminato 0.1N. luego ordenamos los tubos del 1 al 10 y agregamos las siguientes cantidades de agua para cada uno: 8.38 ml, 7.75 ml, 8.75 ml, 8.5 ml, 8 ml, 7 ml, 5 ml, 1 ml, 7.4 ml y 5.8 ml. Después agregamos 0.62 ml al tubo 1 y 1.25 ml al tubo dos de Ac. Acético 0.01N. Luego del tubo 3 al 8 agregamos las siguientes cantidades de Ac. Acético 0.1N en ese orden: 0.25 ml, 0.5 ml, 1 ml, 2 ml, 4 ml y 8 ml. Por último agregamos 1.6 ml de Ac. Acético 1.0N al tubo 9 y 3.2 ml de Ac. Acético al tubo 10, mezclamos y observamos cambios que se presenten en la solubilidad del albuminato en cada tubo.

Resultados:

Prueba de Brand

Esta prueba es utilizada para identificar los aminoácidos que poseen grupos sulfhidrilos que estén libres, en este experimento los aminoácidos que reaccionan a esta prueba son la Cisteína y la Cistina, tomando un color púrpura en el caso de la cisteína y uno tono rosado en la Cistina.

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