Cloroplastos

Trabajo práctico nº 7

Cloroplastos

OBJETIVO:

A partir de hojas de espinaca aislar cloroplastos y comprobar que estén fotosintéticamente activos. Luego analizar el efecto de detergentes e iluminación a diferentes magnitudes de onda sobre su capacidad fotosintética.

INTRODUCCION:

A partir de las sencillas moléculas de CO2 y de H2O, la fotosíntesis convierte la energía de la luz solar en energía química de dos moléculas: ATP y NADPH que luego son utilizadas para impulsar la síntesis de moléculas de almacenamiento como glucosa durante la etapa oscura o independiente de la luz. La fotosíntesis se efectúa en las plantas y algas eucariotas y en ciertos tipos de procariotas como las cianobacterias, todos los cuales son autótrofos.

En eucariotas la fotosíntesis es llevada a cabo íntegramente dentro de las organelas especializadas: los cloroplastos.

DESARROLLO:

Los docentes comenzaron por lavar con H2O unos 200g de espinaca .Luego las hojas fueron escurridas, cortadas en trozos y depositadas en el vaso de licuadora. Posteriormente agregaron 350ml de BH10 frío y procedieron a licuar el contenido por unos minutos.

El contenido del vaso fue filtrado y llevado a la centrífuga a 5000 rpm durante 10 min a 4ºC.

En paralelo los diferentes grupos comenzaron con el armado del gradiente de sacarosa.

Utilizando una pipeta Pasteur se agregaron las soluciones de BH60, BH40, BH20 , en el orden mencionado y lentamente sobre la pared del tubo para mantener las capas de diferente % de sacarosa (densidad).

Terminada la centrifugación, se volcó el sobrenadante en la pileta del laboratorio y se resuspendió el pellet de cloroplasto BH10 ,éste es un buffer de homogenización, disolviéndolo con la pipeta Pasteur teniendo cuidado de no formar espuma y fue colocado en hielo.

Luego se procedió a cargar al tope del gradiente toda la suspensión de cloroplasto y fue centrifugado .

Finalizada la segunda centrifugación obtuvimos a los cloroplastos enteros aislados de los demás componentes celulares situados entre la capa de BH40 Y BH60. Fue extraído cuidadosamente con una pipeta Pasteur y colocado en un tubo eppendorf limpio, el cual fue puesto en hielo inmediatamente.

CONCLUSION y DISCUCION:

Se prepararon 3 tubos por duplicado para realizar la reacción de Hill y analizar si hay actividad fotosintética.

Tubo 1 2 3

BH10 4ml 3ml 3ml

DCPIP - 1ml 1ml

Susp. de cloroplasto 2 gotas - 2 gotas

• BH10 buffer de homogeneización

• DCPIP: aceptor artificial de electrones que cambia de color dependiendo de su estado oxidado ó reducido. Usado para revelar la actividad fotosintética.

Los tubos 1,2 y 3 fueron depositados bajo la luz. Los tubos 1’,2’,3’ fueron depositados en el interior del locker en la oscuridad. Se medio el tiempo necesario para llegar al efecto acromático (desaparición de sustrato): 7 minutos aproximadamente.

Para los tubos 1: Al no contener DCPIP (aceptor artificial de electrones) no se produce la cadena correspondiente y se observa la coloración verde de los cloroplastos

Para los tubos 2: Si contienen DCPIP

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