Creacion de un mutante de fragaria ananassa

Generación de un mutante para el gen FaMYB1 de Fragaria ananassa utilizando la herramienta de edición genómica CRISPR/Cas9

Andrés Lagos Basoalto. Licenciatura en Ciencias con Mención en Biología. Curso de Biología Molecular. Facultad de Ciencias, Universidad de Chile. 29 de noviembre de 2021.

Introducción

Desde hace ya muchos años se ha puesto interés en el estudio de los flavonoides, metabolitos secundarios ampliamente abundantes en el reino vegetal, debido a sus potenciales efectos benéficos sobre la salud. Las antocianinas, pertenecientes a la familia de los flavonoides, han adquirido especial atención debido a los numerosos beneficios declarados y potenciales que presentan para la salud humana, entre ellos encontramos un efecto antioxidante [1], supresión de células cancerígenas [2], potencial capacidad antiinflamatoria [3] y propiedades hipoglicemiantes [4], entre otras. Sin embargo, el organismo humano no puede producir estas sustancias químicas por lo que deben ser adquiridas a través de la dieta [5]. Las vías metabólicas que subyacen las biosíntesis de las antocianinas han sido bien estudiadas y ya se tiene conocimiento sobre la gran gama de enzimas y factores de transcripción implicados [6]. Se ha encontrado evidencia que ubica a diversos factores transcripcionales de la familia R2R3-MYB como reguladores del metabolismo secundario en plantas [7,8] y específicamente, una fuerte actividad represora de la síntesis de antocianinas, por lo que la mutación de genes codificantes para dichos FTs lleva a mayores niveles de antocianinas en los tejidos de las plantas [9,10,11,12]. En la fresa (Fragaria x ananassa), el factor de transcripción FaMYB1 tiene un importante control negativo sobre los niveles de antocianinas en el fruto, ante una sobreexpresión del gen los niveles de antocianinas disminuyen, mientras que al silenciar el gen los niveles aumentan significativamente [10]. Debido a que estudios anteriores que dan cuenta de la mayor acumulación de antocianinas vía silenciamiento del gen FaMYB1 (u homólogos) se han realizado con técnicas de silenciamiento temporal [10,13], en el presente trabajo se propone la utilización de la nueva tecnología CRISPR/Cas9 como herramienta para la edición del genoma de Fragaria x ananassa, generando una línea mutante para el gen FaMYB1 que presente alto contenido de antocianinas, siendo así una buena alternativa de maximizar la ingesta de este flavonoide sin necesidad de ingerir grandes cantidades de fruta, obteniendo los grandes beneficios para salud que fueron descritos anteriormente.

Marco teórico

Como con muchos otros genes y proteínas vegetales, la caracterización funcional de los genes de la familia R2R3-MYB (factores de transcripción R2R3-MYB) se llevó a cabo en Arabidopsis thaliana, encontrando que dada su amplia distribución en el genoma y expresión en diversos tejidos y bajo distintas condiciones, hacían presumir su participación regulatoria en varios procesos [14], dentro de las cuales se encuentra un importante rol regulatorio en los procesos de biosíntesis de flavonoides propios del metabolismo secundario de las plantas [7]. En dichas vías metabólicas encontramos a estos factores de transcripción ejerciendo funciones tanto activadoras como represoras, siendo de especial interés esta última. Al reprimir la expresión de los genes codificantes para estos represores se logra un aumento en la producción y/ acumulación de antocianinas en plantas. La represión post-transcripcional de genes tipo R2R3-MYB ha logrado resultados satisfactorios en plantas como banana, fresa, uva, manzana, entre otras [12,10,15,16]. Las investigaciones más relevantes para el presente trabajo corresponden a las realizadas en fresa (Fragaria ananassa). Inicialmente se demostró la capacidad represora sobre la síntesis de antocianina del factor de transcripción de fresa FaMYB1 en plantas transgénicas de tabaco [17], también se demostró en la fresa chilena (F. chiloensis) la mayor acumulación de antocianinas mediante el silenciamiento transiente del gen FcMYB1, homólogo a FaMYB1[13]. En 2014 se logra, mediante RNA interferencia el silenciamiento de FaMYB1 en Fragaria ananassa, con el consiguiente aumento de la acumulación de antocianinas en el fruto [10]. Si bien todos los resultados son contundentes, las investigaciones fueron realizadas con técnicas transientes de silenciamiento. Ante la aparición de CRISPR/Cas9 como una técnica novedosa, económica y significativamente precisa, se ha puesto interés en su aplicación al campo de estudio descrito, así, recientemente se ha aplicado CRISPR/Cas9 para la edición genómica de plantas, por ejemplo, silenciando genes que codifican para enzimas cruciales para la biosíntesis de antocianinas, como F3’H cuyo knock-out fue logrado mediante dicha técnica en frambuesa [18]. Y aún más relevante, se logró el silenciamiento vía CRISPR/Cas9 de un factor de transcripción tipo R2R3-MYB en álamo [11], lo que sienta un precedente de la posibilidad cierta de aplicar la técnica para el objetivo de este trabajo, la mutación permanente del gen FaMYB1 para generar una línea mutante de Fragaria ananassa cuyos niveles frutales de antocianinas sean elevados, abriendo así la puerta de entrada a un alimento potenciado en nutrientes de beneficioso para la salud humana. Hasta donde sabemos, actualmente no se cuenta con algún protocolo ampliamente aceptado para el trabajo con CRISPR/Cas9 en Fragaria ananassa, por lo cual se recurrirá a protocolos utilizados es otras plantas, esperando sean aplicables y/o adaptables para la planta con que se trabajará.

Hipótesis

La mutación del gen FaMYB1 utilizando la herramienta de edición genómica CRISPR/Ca9 permite la generación de una línea mutante de Fragaria ananassa cuya cantidad de antocianinas en frutos es significativamente elevada y mayor a la encontrada en plantas WT.

Objetivos

El objetivo principal del trabajo es aplicar la técnica CRISPR/Cas9 en la planta de fresa (Fragaria ananassa), específicamente para editar el gen FaMYB1 que codifica para un represor de la vía de síntesis de antocianinas, obteniendo así una línea de plantas con sobreexpresión de estos flavonoides, para poner a disposición de los seres humanos una planta genéticamente modificada cuyos beneficios nutricionales y para la salud en general están potenciados.

Materiales y métodos

Obtención de las plantas: Al igual que Fait et al. [19], las plantas de Fragaria ananassa serán obtenidas desde los cultivos Herut, fresa cultivada en la zona costera de Sharon en Israel.

Extracción de RNA y aislamiento de la secuencia del gen FaMYB1: La extracción y aislamiento de RNA y posterior síntesis de cDNA mediante RT-PCR se llevará a cabo utilizando los kits Plant RNA Isolation Aid (Ambio, Carlsbad, CA, USA) y Superscript III First-Strand synthesis system (Invitrogen, Tokyo, Japan), tal como se describe en Kamodura-Ishikawa et al. [10]. Una vez que se tenga el pool de cDNA, se procede a aislar específicamente el gen FaMYB1 de interés, para esto se llevará a cabo una amplificación por PCR utilizando partidores específicos para el gen [10].

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