Cuantificación de una actividad celulasa

Protocolo N°18 Cuantificación de una actividad celulasa

Objetivo: Cuantifica la actividad celulasa de un cultivo de Brevibacillus agri E12 producido en diferentes medios (leche, LB, harina de soja, cáscara de soja, residuo liquido y solido de la extracción acuosa asistida por enzimas).

Materiales y métodos

Eppendorf 1,5ml

Solución CMC 1% en tampón citrato de Na 0,05M pH 4,8

1% DNS

1,6% NaOH

30% Sal Rochelle (Tartrato de potasio y sodio tetrahidratado)

Para la aplicación del método DNS de Miller (Miller, 1959) se necesita preparar el reactivo DNS disolviendo 0.8g de NaOH en agua destilada, luego se adicionan 15g de sal de rochellle y 0.5g de DNS (acido 3,5-dinitrosalisilico). Esta mezcla se afora a 50 ml con agua destilada y se almacena en un frasco color caramelo a 4°C.

Procedimiento (Afzal et al., 2012)

1. Se mezclan 50 µl de sobrenadante de cultivo con 50 µl de una solución de CMC 1% en tampón citrato de sodio 0,05M pH 4,8
2. Se incuba en baño de agua a 40°C, 60 minutos
3. Luego se añade 300 µl del reactivo DNS y se colocan las muestras en agua hirviendo 10 minutos
4. Las muestras se enfrían a temperatura ambiente y se lee la absorbancia a 540/590 nm
5. A partir de la curva estándar de glucosa obtenida en el protocolo N°17 se determinará la actividad celulasa
6. La actividad se expreso como unidades internacionales por litro (U/L), donde una unidad es la cantidad de enzima que libera 1 µmol de glucosa por minuto en las condiciones descriptas
7. Los controles (blancos) fueron de enzima sin sustrato y sustrato sin enzima, los cuales se utilizaron para corregir los valores de las muestras problemas
8. Calculos:

[Glucosa]= µmoles/L

µmoles=g/PMglucosa*106

PMglucosa=180.06 g/mol

Actividad enzimática= [Glucosa]/tiempo (min)= [U/L]

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