Curva tipo de azucares reductores

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL[pic 1][pic 2]

Escuela Nacional de Ciencias de Biológicas

“Laboratorio de Bioquímica”

Curva tipo de azucares reductores.

Objetivos:

-Obtener la actividad de la enzima invertasa.

-Construir una curva de calibración

-Transformar las lecturas de absorbencia a micromoles de azúcar reductor.

-Interpretar la curva de calibración.

Introducción:

Las enzimas son moléculas de naturaleza proteica, que catalizan una gama amplia de reacciones biológicas[pic 3]

Una curva tipo es una representación gráfica de la absorbancia frente la concentración de un analito. La absorbancia se puede obtener mediante el método de Miller que es una técnica colorimétrica que emplea ácido 3,5 dinitrosalicílico para la hidrolisis de polisacáridos presentes en una muestra. La absorbancia se determina por medio de un espectrofotómetro.[pic 4]

El DNS reacciona unicamente con los azucares reductores; la técnica de Miller es aplicable a todos los procedimientos de sistemas de cultivos de medios líquidos y sólidos cuya molécula de sustrato sean azucares reductores. Un azúcar reductor es aquel que tiene la capacidad de reducir un reactivo y oxidarse, dando como productos un ácido aldónico y el reactivo reducido. Esta técnica sirve para cuantificar los azucares reductores producidos durante una fermentación o para cuantificar los productos de una reacción enzimática.

Resultados:

La ecuación de regresión lineal de la curva tipo es:

[pic 5]

[pic 6]

Gráfica 1. Curva tipo de azúcares reductores

Ejemplo de cálculo para la obtención de μmoles de AR

Tubo 2.

[pic 7]

[pic 8]

Discusión:

Para la construcción de la curva tipo se prepararon 6 tubos, un testigo y 5 problemas. Los tubos contenían glucosa y fructosa, que son el producto de la reacción de la invertasa  sobre la sacarosa, esto se debe a que la invertasa es una enzima de tipo hidrolasa, que rompe el enlace glucosídico de la sacarosa al estar en presencia de agua.

La glucosa es un azúcar reductor porque el carbonilo de su aldehído es muy reactivo y permite la reacción con el 3,5 DNS, en donde este se reduce (bajo condiciones de alta temperatura y un pH alcalino) al cambiar el oxígeno del grupo nitro por hidrogeno, produciendo un grupo amino que tiene la característica de ser un grupo electrodonador, lo que le da estabilidad al 3-nitro,5-amino salicilato que se caracteriza por su coloración roja.

Por otro lado, la fructosa, no es un grupo reductor puesto que su carbonilo corresponde a una cetona que no permite la reacción con el 3,5 DNS, sin embargo, al estar en un pH alcalino por efecto del 3,5 DNS la fructosa presenta un equilibrio ceto-enólico y cuando se encuentra en su forma enólica es capaz de reducir al 3,5 DNS.[pic 9]

...