CÉLULAS DE LEVADURA

Xilosa y algunas fuentes de carbono (no azúcares) que causan represión catabólica en Saccharomyces cerevisiae

Abstracto

La glucosa y otros azúcares, tales como galactosa o maltosa, son capaces de provocar la represión catabólica de carbono en Saccharomyces cerevisiae (levadura de cerveza). Aunque intermediarios glucolíticos han sido sugeridos como señal para la represión, no hay evidencia de que tal mecanismo de control sea válido. El establecimiento de una correlación entre los niveles de metabolitos intracelulares y el grado de la represión catabólica puede facilitar la identificación de moléculas de señal potenciales en el proceso. Para establecer un marco de referencia para un estudio de este tipo, la represión producida por xilosa, glicerol y dihidroxiacetona sobre genes pertenecientes a diferentes circuitos reprimibles se puso a prueba, utilizando una cepa de S. cerevisiae ingeniería capaz de metabolizar la xilosa. La xilosa aumentó la represión de diversas enzimas en presencia de etanol por lo menos 10 veces; los ARNm correspondientes no se detectaron en estas condiciones. Xilosa también deteriora la desrepresión (Inhibe la represión de un gen) de galactoquinasa e invertasa. El glicerol y la dihidroxiacetona disminuyeron de 2 a 3 veces la desrepresión observada en etanol o galactosa pero no afectó desrepresión de la invertasa (enzima que convierte la sacarosa en glucosa y fructosa).

Introducción

Está bien establecido que, además de la glucosa y hexosas relacionadas, otras azúcares como la galactosa y maltosa, son capaces de reprimir genes implicados en el metabolismo de otras fuentes de carbono. Estudiamos la capacidad de la xilosa, xilitol, glicerol y dihidroxiacetona para reprimir la expresión de una variedad de genes de la Saccharomyces cerevisiae. Utilizamos cepas de ingeniería (conjunto de especies bacterianas) capaces de crecer en xilosa como fuente de carbono.

Materiales y métodos

Cepas y condiciones de crecimiento

Las cepas de levadura usadas fueron TMB3001c y CEN.PK102-5B. Las levaduras fueron creciendo a los 30°C, con agitación, en un medio que contenía 1% de extracto de levadura y 2% de peptona (YP). 6 horas de agitación para las enzimas gluconeogénicas, 5 horas para la galactoquinasa y 3 para la invertasa.

Ensayos enzimáticos

Los extractos de levaduras fueron preparados por agitación con perlas de vidrio. Y la galactoquinasa fue medida espectrofotométricamente. El extracto de proteína fue determinado usando el método BCA (cúprico a cuproso con ácido bicinconínico =color morado) con albúmina de suero bovino como estándar. La invertasa fue ensayada usando todas las células y midiendo la glucosa formada en la reacción con la hexoquinasa y glucosa 6P-deshidrogenasa.

Otros ensayos

La xilosa fue determinada con floroglucina, usando un método colorimétrico (Diferencia de absorción del OD554 Y 480), mientras que el xilitol fue determinado por un método enzimático (Reducción del NAD en una solución buffer que corría en paralelo con el xitosol).

Determinación de los metabolitos intracelulares

Las células de levadura fueron recolectadas por filtrado y congelado en nitrógeno; los metabolitos fueron extraídos con ácido perclórico bajo el líquido nitrogenado y fueron medidos espectrofotométricamente.

Análisis de ensayo Northern

El total del RNA fue extraído por esta técnica (se toma la mezcla de

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