DETERMINACIÓN DE VITAMINA A EN ALIMENTOS POR HPLC

UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA

FACULTAD DE INGENIERÍA

DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA

QUÍMICA ANALÍTICA E INSTRUMENTAL

DETERMINACIÓN DE VITAMINA A EN ALIMENTOS POR HPLC

RESUMEN

El análisis cuantitativo de vitamina A en alimentos se puede realizar por medio de técnicas cromatográficas que consisten en la separación de un analito, en este caso β-caroteno, de los demás componentes de la mezcla en donde se encuentra (en un jugo por ejemplo). Se describirá el fundamento general de la HPLC que básicamente consiste en una retención selectiva bajo unas condiciones específicas lo que la hará más eficaz con este tipo de muestras liposolubles.

OBJETIVO

Conocer los procesos que conlleva una HPLC; desde la derivatización de la muestra a analizar, la cromatografía en sí y la medición de una propiedad que nos indicará la cantidad de sustancia x.

INTRODUCCIÓN

El término vitamina A se aplica genéricamente a todos los derivados de la β-ionona, distintos de las provitaminas A de tipo carotenoide, que exhiben la actividad biológica del trans retinol. De los más de 400  carotenoides que han sido caracterizados, sólo unos 30  tienen actividad de provitamina A, el carotenoide más activo es el trans β-caroteno. Para convertir todas las fuentes de vitamina A y carotenoides de la dieta en una unidad simple se ha utilizado el término equivalente de retinol (ER). Generalmente 1 µg de retinol equivale a 6 µg de beta caroteno ó 12 µg de carotenoides mixtos. El β-caroteno y otros carotenoides con carácter de provitamina A son convertidos en retinal en las células de la mucosa intestinal.

[pic 1]

Figura 1. Estructura del retinol o vitamina A

TÉCNICA

La cromatografía de líquidos de alto rendimiento o HPLC (por sus siglas en inglés, High-Performance Liquid Cromatography) no está limitada por la volatilidad o estabilidad térmica de la muestra. La HPLC es capaz de separar macromoléculas y especias iónicas, productos naturales, materiales poliméricos y una gran variedad de otros grupos funcionales de alto peso molecular.

Para el análisis de vitamina A en alimentos se pueden utilizar 2 modos de esta cromatografía: Fase normal y reversa. La fase reversa se refiere a la fase estacionaria, que es menos polar que la fase móvil.  Está compuesta por sílice al cual se le une el grupo ODS (octadecilsiloxano) y  constituyen un ambiente con características no polares que retendrá con mayor fuerza los analitos menos polares ocasionado un orden de elución de más a menos, contrario a la fase normal, que es del más al menos polar. La HPLC ofrece mayor variedad de fases estacionarias por eso es la más usada para la cuantificación de vitaminas liposolubles dada su selectividad y posibilidad de separación.

La fase móvil está compuesta por H2O y modificadores orgánicos como acetonitrilo, metanol, THF, entre otros, que pueden ser utilizados por aparte o como mezcla, con el fin de proporcionar a la fase móvil diferentes grados de polaridad durante el tiempo en el que eluyen los analitos. La variación de la polaridad es un parámetro que se aplica para mejorar la eficiencia de separación.

Tabla 1. Condiciones de los sistemas de cromatografía para vitamina A

EQUIPO

El sistema de HPLC está formado por varias unidades, cada una de las cuales realiza una función propia:

a) Bomba distribuidora de solvente, que succiona la fase móvil a partir del depósito y lo envía a través del sistema a flujo constante.

b) Columna de fase reversa con un tamaño de poro de 80 A y un tamaño de partícula de 5 µm, con un guarda columna del mismo empaque.

c) Detector rango UV visible, de longitud de onda programable.

d) Integrador automático.

TRATAMIENTO DE LA MUESTRA

1) Se pesa la cantidad suficiente de zanahoria, que contiene una fuente alta de β-carotenos (precursores de la vitamina A), para obtener 10 mililitros de jugo que será nuestro extracto inicial.

2) Se miden 10 mL de la muestra y se transfieren a un matraz volumétrico de 250 mL.

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