DIATOMEAS

OBTENCION DE ADN POR LA TECNICA FENOL CLOROFORMO

El fundamento es la solubilidad (desnaturalización) de ácidos nucléicos, proteínas y lípidos en solventes orgánicos, esta técnica ha sido recientemente modificada debido a la gran toxicidad que posee el Fenol, actualmente se añade alcohol isoamílico que tiene la misma finalidad que este, exceptuando la toxicidad.

Esta técnica consta de tres fases:

1. Lisis celular
2. Eliminación de Proteínas
3. Precipitación y Limpieza de ADN

1. LISIS CELULAR: Este paso consiste en desestabilizar las estructuras que se encuentran en el citoplasma liberándolo al medio, para esto se utilizan compuestos (tampones) como: detergente SDS, agentes quelantes como el EDTA, NaCL, tampón Tris HCl y Proteinasa K, se recomienda realizar esto a una temperatura no mayor a 80 °C (ideal 50 °C) debido a que a esta temperatura el DNA se degrada.

1. ELIMINACION DE PROTEINAS: Después de la lisis celular, se adiciona una mezcla de Fenol:cloroformo:alcohol isoamílico y se centrifuga, provocando dos fases acuosa (DNA) y una fase orgánica (Proteínas).

1. PRECIPITACIÓN Y LIMPIEZA DE ADN: el sobrenadante (Fase acuosa) se recupera añadiendo acetato de sodio, cloruro de sodio o acetato de amonio, esto proporciona una capa iónica al DNA facilitando la precipitación, se centrifuga y se descarta el sobrenadante, posterior se añade etanol al 70% para eliminar los residuos de sales y promover la precipitación de ácidos nucleícos, el etanol eliminando las moléculas de agua deshidratando el DNA,  este paso de eliminación de sales se realiza mínimo 2 veces para eliminar la mayor cantidad de sales presentes en la muestra. Seguido de esto se deja cercar el etanol y se agrega agua ultrapurificada o tampón de Tris para rehidratar y re-suspender el ADN y poder hacer el corrido electroforético o PCR.

[pic 1]

Fundamentos de los compuestos:

1. Tampón Tris-EDTA (TE): es un inhibidor de nucleasas y un buen tampón para la conservación del ADN, elimina los cationes de la solución.
2. Tampon Tris HCl: mantiene el ph estable.
3. NaCl: protege al ADN con una capa ionica evitando ser digerido por las ADNasas.
4. Proteinasa K: degrada proteínas y enzimas.
5. Fenol: desnaturaliza las proteínas contaminantes de la muestra. Se usa para eliminar la proteínas (proteasas, nucleasas...); disminuye el rendimiento de la PCR a concentraciones del 0,2% y al 0,5% la inhibe completamente
6. Cloroformo: permite la separación de 2 fases; el ADN queda en la fase acuosa (Parte superior) y en la fase orgánica quedan las proteínas y otros contaminantes (Parte inferior)
7. Etanol e isopropanol: precipitan los ácidos nucleícos. Tienen efectos inhibitorios a concentraciones superiores al 1%
8. Isotiocianato de guanidinio: es un agente caotrópico (favorece la disolución en agua de compuestos insolubles) que inhibe las RNasas y conserva el ARN
9. El SDS es un detergente iónico que desnaturaliza las proteínas pero también inhibe la PCR a concentraciones mínimas, elimina membranas y lípidos.

LAS RNAsas o DNAsas son bichitos (no sé cómo llamarlos) que degradan (se comen) el DNA o RNA evitando asi que se recolecte muestra.

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