Desnaturalización De La Enzima Peroxidasa

Desnaturalización de la enzima peroxidasa por temperatura.

RESULTADOS

Se realizó una dilución 1/10 usando 0,2 mL de solución de peroxidasa y 1,8 mL de buffer fosfato, la cual se llevó, en un tubo de ensayo, a baño termostatizado aproximadamente a 95º C. De esta solución se tomaron 200 µL a los 0, 5, 10, 15 y 30 minutos de incubación y de enfriarlos inmediatamente en un vaso de hielo por unos minutos.

Para determinar la actividad de peroxidasa en cada muestra se llevó con una pipeta 3 mL de solución de sustrato (10 µL de peróxido de hidrógeno y 40 µL de guayacol en 20 mL de buffer fosfato), a la celda del espectrofotómetro y se le añadió 200 µL de cada muestra (0, 5, 10, 15 y 30 minutos). La absorbancia se midió en un espectrofotómetro JENWAY 6305.

Los datos fueron tomados cada 15 segundos y se registró el cambio de absorbancia a 470 nm en la Tabla No. 1.

Tiempo (minutos) 0 5 10 15 30

Conteo (Intervalos de 15(s) )

1 0,205 0,278 0,492 0,305 0,107

2 0,223 0,370 0,553 0,416 0,125

3 0,265 0,468 0,624 0,562 0,138

4 0,308 0,587 0,710 0,678 0,135

5 0,344 0,685 0,822 0,789 0,169

6 0,383 0,791 0,887 0,917 0,183

7 0,423 0,872 0,981 1,042 0,200

8 0,473 0,960 1,016 1,162 0,216

9 0,514 0,972 1,088 1,281 0,236

10 0,560 1,068 1,160 1,397 0,253

Tabla No. 1 Relación de tiempo de incubación y absorbancia de la muestra.

Se tomaron los datos de absorbancia según el tiempo de incubación para realizar una gráfica (Gráfica No. 1) de Absorbancia vs tiempo de incubación.

Gráfica No. 1 Absorbancia versus tiempo de incubación.

Teniendo R^2 de cada línea de tendencia para la relación de los datos de cada muestra, se observa que los datos tienen aproximadamente más del 98% de precisión.

Tomando los valores de absorbancia de cada muestra, se determinó la concentración usando la ecuación de la Ley de Lambert-Beer. Los resultados se registraron en la Tabla No. 2.

Tiempo (minutos) 0 5 10 15 30

Conteo (Intervalos de 15(s) )

1 3,13724E-06 4,2544E-06 7,52937E-06 4,6676E-06 1,63749E-06

2 3,4127E-06 5,6623E-06 8,46289E-06 6,3663E-06 1,91295E-06

3 4,05545E-06 7,1621E-06 9,54945E-06 8,6006E-06 2,1119E-06

4 4,71351E-06 8,9832E-06 1,08656E-05 1,0376E-05 2,06599E-06

5 5,26444E-06 1,0483E-05 1,25796E-05 1,2075E-05 2,58631E-06

6 5,86128E-06 1,2105E-05 1,35743E-05 1,4033E-05 2,80056E-06

7 6,47342E-06 1,3345E-05 1,50128E-05 1,5946E-05 3,06072E-06

8 7,2386E-06 1,4691E-05 1,55485E-05 1,7783E-05 3,30558E-06

9 7,86605E-06 1,4875E-05 1,66503E-05 1,9604E-05 3,61165E-06

10 8,57002E-06 1,6344E-05 1,77522E-05 2,1379E-05 3,87181E-06

Tabla No. 2 Cambio de producto (concentración: M^(-1) ) versus el tiempo.

Se tomaron los datos de concentración según el tiempo de incubación para realizar una gráfica (Gráfica No. 2) de Cambio de producto versus el tiempo de incubación.

Vemos que la gráfica obtenida es igual a la Gráfica No. 1.

Para el cálculo de la actividad enzimática de la peroxidasa usamos la ecuación:

Actividad= ((m(3.1)(60)(1*〖10〗^(-3) )))/5200

Se hicieron los cálculos correspondientes, utilizando las pendientes relacionada en la Gráfica No. 1. Los resultados se tabularon en la Tabla No. 3.

Tiempo de incubación (minutos) Actividad Enzimática (UI)

0 2,89E-7

5 1,82E-7

10 2,07E-7

15 1E-7

30 3,9E-8

Tabla No. 3 Relación de tiempo de incubación contra actividad enzimática de la peroxidasa.

Estos datos fueron

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