Determinacion De Aminoacidos

CROMATOGRAFÍA CUANTITATIVA DE CAPA FINA

• Técnica simple y de fácil desarrollo.

• Los componentes de una mezcla se separan por diferencia de solubilidad entre dos sistemas disolventes.

• Elementos del sistema cromatográfico: soporte, F.E.

• F.E .,gel de sílica. F.M., butano:agua:ácido acético.

• Parámetro experimental asociado a la técnica: el Rf relacionado con la solubilidad relativa de un compuesto entre la F.E. y F.M.

• Para la cuantificación se raspa el absorbente que rodea a cada mancha y se procede a analizar el constituyente de la muestra mediante la reacción con la ninhidrina (570nm).

• Actualmente, la CCF ha sido desplazada por la HPLC, ya que es más confiable y sencilla.

HPLC EN FASE REVERSA

• Técnica cuantitativa, rápida y altamente sensible; produce buena resolución entre compuestos.

• Inconveniente de la técnica: preparación de derivados antes o después de la separación cromatográfica.

 F. E. es ‹ polar que la F. M.

 F .E., poliestireno y divinilbenceno entrecruzados, ODS (C18).

METODOS DE DERIVACIÓN PARA LA SEPARACION CROMATOGRAFICA DE AMINOÁCIDOS.

1. Reacción con ninhidrina

• Consiste en la reacción del grupo α-amino de un AA con ninhidrina (entre pH 3 y 4, reacción en caliente).

• Complejo de coloración que varía de azul a violeta intenso, con máxima absorción a 570 nm.

• Los aminoácidos prolina e hidroxiprolina dan un color rojo que pasa rápidamente a amarillo, con máxima absorción a 440 nm.

• Café para la asparagina que tiene un grupo amido en la cadena lateral.

• Destruye la muestra.

2. REACCIÓN CON ORTO-FTALDEHÍDO

• El OPA es un reactivo que no tiene fluorescencia natural.

• Reacciona con Aas con grupo amino 1º en presencia de 2mercaptoetanol (MCE) o etanotiol (pH 9-11)en medio acuoso, produce derivado isoindólico fluorescente, midiendo la emisión entre 400-500 nm.

Ventajas Del OPA

 Método rápido sensible y selectivo para todos los Aas con grupos amino primario.

 Mayor estabilidad de los derivados empleando Etanotiol.

 Adición de hipoclorito, permite la formación de OPA-derivados provenientes de Aas secundarios.

 Técnica es diez veces más sensible que la reacción con ninhidrina.

Desventajas Del OPA

 Relativa inestabilidad de sus derivados (por acidificación)

 No reacciona con Aas secundarios (prolina e hidroxiprolina)

 La baja respuesta de la cisteína, lisina e hidroxilisina. Fácil descomposición del derivado, presencia de dos estructuras isoindólicas fluorescentes que interaccionan.

3. REACCIÓN CON FLUORESCAMINA

• Aas primarios reaccionan con fluorescamina (pH 9-11) ---- Producto fluoresente con máximo de emisión a 475 nm.

• Producto es inestable en agua, preparar en acetona.

• Aas 2º No reaccionan, deben reaccionar antes con hipoclorito, cloramina-T.

• Reacción rápida a T ambiente, pero no tan sensible como con ninhidrina.

4. REACCIÓN CON 9-FLUORENILMETIL CLOROFORMATO

• El FMOC-Cl reacciona rápido con todos los Aas para formar derivados carbamados altamente fluorescentes.

• pH alcalino y T amb.

• Los derivados son estables y se pueden almacenar por varios días en el refrigerador.

• Durante la reacción con FMOC-Cl, productos de hidrólisis del reactivo (9-fluorenilmetanol) deben eliminarse con solvente orgánico (ELL) para no interferencia en la cuantificación.

5. REACCIÓN CON CLORURO DE DANSILO

• Reacciona con Aas primarios y secundarios para producir derivados fluorescentes de color amarillo intenso (entre pH 9.5-11.5) λex 360 nm ; λem 470 nm. Reaccion 30-35’, T ambiente, oscuridad.

• El dansil Aa es insoluble en agua y se extrae con disolventes orgánicos.

• Se debe evitar la exposición a la luz de los dansilderivados, por ser fotosensibles.

• Los dansilAas son estables al menos 7 días si se mantienen a –4 °C.

• Se emplea para el análisis del N terminal de los Aas en péptidos y proteínas (formación de enlace sulfonamida).

• Detecta picomoles y hasta femtomoles.

Desventajas

 Largo tiempo de reacción.

 El péptido se hidroliza totalmente, se pierde secuencia de Aas.

 Formación de la dansilamida representa una limitación del método, evitar el exceso de cloruro de dansilo.

6. REACCIÓN CON CLORURO DE DABSILO

• Reacciona con Aas 1º y 2º dando derivados con gran absorbancia en el rango del visible, 420 nm.

• Condiciones reacción: 70 °C, pH de 8-8.5.

• Derivados son estables durante 4 semanas a Tamb.

• Desventaja: tolerancia limitada a la presencia de sales.

• Se detectan picomoles de Aas.

7. REACCIÓN CON ISOTIOCIANATO DE FENILO

• Aas 1º y 2º a pH alcalino producen derivados de feniltiocarbamol, que pueden ser registrados en el UV a 240-255 nm.

• Se puede dar la ciclación tratándose con ácido en un solvente orgánico.

• Reacción es completa a los 5-10’. Usar exceso de reactivo.

• Se detectan picomoles de Aas. Método es selectivo.

REACCIÓN CON ISOTIOCIANATO DE FENILO

• Productos son estables hasta 4 semanas a -20 °C.

• Contaminación por trazas de iones metálicos, algunas sales, iones tampón reducen la formación del producto.

• Formación del derivado es laboriosa,por ello, el método (Degradacion de Edman)es más utilizado para la determinación de la secuencia peptídica.

En este método, el residuo amino-terminal se etiqueta y se separa del péptido sin afectar a los enlaces peptídicos entre los otros residuos.

8. REACCIÓN CON 4-CLORO -7- NITROBENZOFURAZA

NBD-Cl ( no es fuorescente) reacciona con el grupo alfa amino de Aas 1° y 2° dando complejos de transferencia de carga fluoroescentes en medio no acuoso (metanol, etanol acetonitrilo).

La intensidad de fluorescencia disminuye significativamente en

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