ENSAYOS ENZIMÁTICOS

ENSAYOS ENZIMÁTICOS

Son 2 los propositos de hacer ensayos enzimáticos: Para saber si hay presencia de alguna enzima de interés en algún organismo o tejido y para determinar la cantidad exacta de ezima en alguna muestra.

Hay reglas generales para realizar estos ensayos, Sin embargo aunque se tomen las condiciones idénticas para hacer los mismos ensayos de las enzimas, estos pueden dar resultados muy diferentes De hecho, la Actividad enzimática depende de factores múltiples y es necesario la Comprensión de las características particulares de las enzimas no obstante no se garantiza que los resultados vayan a ser exactos.

Se puede confirmar que las enzimas dependen decisivamente de ciertas condiciones como son temperatura, pH, y resistencia de iones, solo tomando en  cuentas estas condiciones pueden ser comparados con fiabilidad. Sin embargo esto no es suficiente para proponer reglas generales en los ensayos debido a la gran diversidad de enzimas y sus propiedades, por esto mismo los ensayos enzimáticos son adaptados a enzimas individuales y no se aplican las mismas reglas. Algunas enzimas necesitan de óptimas condiciones para poder activarse y ser detectadas.

Aunque se pueden encontrar descripciones detalladas de los ensayos enzimáticos en La bibliografía indicada suele ser necesario modificar el procedimiento o instrumentación Para adaptarlo a las Características especiales de una enzima individual

Una de las reglas predominantes es la observación clara de las reacciones catalizadas por la enzima, por lo tanto el objetivo de un ensayo enzimático es observar la relación de la conversión de un sustrato en un producto con el tiempo,
Para lograrlo, debe encontrarse un procedimiento para identificar el producto. Dado que la formación del producto está directamente relacionada con la desaparición del sustrato, su disminución es una medida adecuada de la reacción. En los casos en que se forman dos o más productos, o dos o más moléculas de sustrato están implicadas en la reacción, la determinación de un solo componente es suficiente. Obviamente, se elegirá el componente de reacción detectable más fácil.

Se pueden presentar algunos problemas a la hora de hacer mediciones, ya que cualquier método está sujeto a dispersiones,  ya sea por instrumentos mal calibrados, soluciones turbias, contaminación por otras sustancias, polvo etc..

MÉTODOS PARA OBSERVAR REACCIONES ENZIMÁTICAS.

Todos los ensayos enzimáticos miden el sustrato consumido o el producto generado en la reacción durante un tiempo

Un método son las técnicas ópticas. Un caso sencillo es cuando se agrega un compuesto de color el cual aparece o desaparece cuando hay una reacción enzímatica, este proceso se observa a simple vista pero si queremos datos precisos debemos usar instrumentos como un colorímetro, fotómetro o para ser aun mas precisos en nuestros resultados un espectrofotómetro; debido al manejo relativamente fácil y la baja susceptibilidad frente a las distorsiones, los ensayos fotométricos se aplican en la medida de lo posible

Hay otras técnicas ópticas como son la fluorimetría, sin embargo muy pocos sustratos enzimáticos emiten fluorescencia; también existe la turbidimetría y luminometría.

También existen métodos electroquímicos un ejemplo es a partir de los cambios de pH.

Estos métodos mencionados permiten dar seguimiento a la reacción dependiente del tiempo.y se llaman ensayos cntinuos.  Y así poder evaluar su velocidad de reacción y tener un control del curso de la reacción.

En un ensayo discontinuo se toman muestras de una reacción enzimática en intervalos y se mide en ellas la cantidad de producto formado o sustrato consumido, Para determinar la velocidad, la reacción debe detenerse después de un tiempo definido y la cantidad de producto formado o substrato convertido debe analizarse posteriormente mediante una reacción indicadora química o un método de separación, como la HPLC

La mayoría de las enzimas son sensibles al pH y tiene un rango específico en el que se detecta actividad; todas tienen un pH óptimo. El pH puede detener la actividad enzimática al provocar la desnaturalización de la estructura proteica rompiendo enlaces iónicos y puentes de hidrógeno. La mayoría de las enzimas funcionan entre un pH 6 y 8; Al pH en donde la enzima presenta máxima actividad se le conoce con el nombre de pH óptimo. Estos resultados se pueden interpretar pensando que en el pH óptimo la enzima tiene la conformación tridimensional que le permite la mayor actividad catalítica. Si se modifica este pH, la conformación nativa se pierde y la enzima ya no puede catalizar adecuadamente. el pH óptimo es muy variable entre una enzima y otra, pero la mayoría de ellas tiene un pH cercano a 7, aunque por ejemplo la pepsina, que se encuentra en el estómago en donde hay ácido clorhídrico, tiene un pH óptimo igual a 1.5.

Un buffer es la mezcla en concentraciones relativamente elevadas de un ácido y su base conjugada, es decir, sales hidrolíticamente activas. Tienen la propiedad de mantener estable el pH de una disolución frente a la adición de cantidades relativamente pequeñas de ácidos o bases fuertes. Este hecho es de vital importancia en diversos contextos en donde es necesario mantener el pH en un umbral estrecho, por ejemplo, con un leve cambio en la concentración de hidrogeniones en la célula se puede producir un paro en la actividad de las enzimas.

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