El glucógeno es el principal polisacárido de reserva de las células animales y al igual que la amilopectina es de forma en ramificado y presenta alfa-glucosa enlaces 1,4 en la parte lineal y alfa-1,6 en los puntos de ramificación.

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INTRODUCCIÓN

El glucógeno  es el principal polisacárido de reserva  de las células  animales y al igual que la amilopectina es de forma en ramificado y  presenta alfa-glucosa enlaces 1,4 en la parte lineal  y alfa-1,6  en los puntos de ramificación. El glucógeno es especialmente abundante en el hígado, en donde puede alcanzar hasta el 7% del peso húmedo; se halla presente también en el músculo esquelético. En células hepáticas, el glucógeno se encuentra almacenado en gránulos grandes, contiene unidas en forma muy íntima, las enzimas responsables de su síntesis y degradación.

El glucógeno puede hidrolizarse por la acción de la enzima amilasa que se encuentra en la saliva y jugo pancreático, la cual rompe los enlaces a 1-4 de las ramas exteriores del glucógeno para dar glucosa, una cantidad pequeña de maltosa y un “núcleo” resistente llamado dextrina límite.

Los polisacáridos son considerablemente menos solubles que los monosacáridos en solución alcohólica, el glucógeno puede separarse de los azúcares y otros compuestos solubles en agua por precipitación con alcohol. La cuantificación puede hacerse hidrolizando el glucógeno seguida de una prueba para azúcares reductores. Puede utilizarse el método general para carbohidratos con la utilización de antrona (9-oxiantraceno) que reacciona con los carbohidratos y produce un color azul característico.

Reacciona con los monosacáridos, disacáridos y polisacáridos; dextrinas, almidones, gomas y glucósidos, pero el color producido no es el mismo para los diferentes carbohidratos.

PROPÓSITO ESPECÍFICO DE LA PRÁCTICA

Al término de la práctica, el alumno será capaz de establecer la estructura del glucógeno, así como conocer la función y utilidad fisiológica del homopolisacárido

Resultados Esperados

• Aprenderás a identificar el carbohidrato principal de nuestro metabolismo en forma de glucógeno.
• Conocerás la separación de carbohidratos por sus propiedades
• Identificarás como y donde se encuentra almacenada la glucosa en nuestro organismo.
• Aprenderás a identificar la concentración de azúcar almacenada en hígado.

NORMAS DE SEGURIDAD ESPECÍFICAS DE LA PRÁCTICA

    Normas Oficiales Mexicanas Específicas para la Práctica. Normas oficiales mexicanas que aplican para las actividades a realizar dentro del sistema de prácticas:

NOM-025-STPS-199, NOM-002-STPS-2000, NOM-017-STPS-2001, NOM-018-STPS-2000

Material y equipo:

Equipamiento

Baño de agua hirviendo.

Baño de hielo y agua del grifo.

    Centrífuga.

    Balanza analítica

    Estufa a 35°C.

   Espectrofotómetro y celdas de vidrio

   Placa de calentamiento

Material

Tubos de centrífuga cónicos de plástico con tapón de 50mL y de 15mL  

Tubos de ensaye 3x100

     Guantes de látex.

     Pipetas automáticas (0,1 y 1,0 mL) (puntas).

    Pipetas de vidrio (5,0 y 10 mL).  

Papel de filtro.

    Pinzas para tubo grande

   Vaso de ppdo. de 500mL

   Agitador de tubos

   Caja Petri

Reactivos

Hígado de pollo

Solución de hidróxido potásico 30 %

Solución de tricloroacético al 10% (TCA)

 Solución de sulfato de sodio saturada  

 Etanol al 95%

   Solución de glucosa 9 mg/mL

 Solución de Antrona en ácido sulfúrico (2g/L). Adicionar 660mL de H2SO4 concentrado en 340mL de agua destilada (hacer esta operación teniendo el reciente en baño de agua de hielo y que desperende mucho calor). Agregar después 10g de Tiurea y 0.5g de Antrona, agitado constantemente. (Este reactivo se puede almacenar durante 2 semanas)

Solución amortiguadora de fosfato sódico (pbs 1 x con NaCl 0,005 M)

   Agua destilada

Aislamiento de glucógeno de hígado pollo.

1. Se ponen 3 mL de la solución de hidróxido potásico al 30% en un tubo cónico de 50mL.

1. Se pesa 1 g de tejido (aproximadamente) y se introducen en el tubo anterior.

1. Se calienta en un baño de agua hirviendo, agitando con cuidado para acelerar el proceso, hasta su digestión). USAR PINZAS PARA MANIPULAR LOS TUBOS.¡¡ PRECAUCION: ALCALI HIRVIENDO!!

1. Se enfría el tubo bajo el grifo una vez acabada la digestión.

1. Una vez enfriado el tubo, se añade 0,2 mL de la solución saturada de Na2SO4 y se mezcla fuertemente. Dejar reposar 5 minutos.

1. Se precipita el glucógeno que está en solución por adición de 7 mL de etanol al 95% frío. Se agita y deja en frío en un baño de hielo durante 5 minutos.

1. Se pasa la solución a un tubo de centrífuga cónicos de plástico de 15mL con tapón y se centrifuga a la máxima velocidad (5000 rpm) durante 5 minutos. Se desecha el sobrenadante y se coloca el tubo invertido sobre papel de filtro.

1. Se añaden 5 mL de la solución de TCA al 10% al mismo tubo y se disuelve totalmente el sedimento agitando fuertemente.

1. Se centrifuga de nuevo 5 minutos (5000 rpm).

1. Se añade el sobrenadante obtenido en la última centrifugación, al otro tubo cónico de plástico de 15mL, al que previamente se han añadido 10 mL de etanol al 95%. Se deja reposar 5 minutos para que se produzca la precipitación del glucógeno.

1.  Se centrifuga durante 5 minutos más a 5000 rpm.

1. Una vez acabada la centrifugación se tira el sobrenadante. El sedimento obtenido representa el glucógeno prácticamente excento de sustancias contaminantes. Dejarlo secar en la estufa a 35°C hasta su utilización.

Cuantificación de azúcares en la muestra

1. Se disuelve este glucógeno a razón de 8 mg de dicho glucógeno por mL de de PBS 1 con NaCl 0,005 M (el ión que activa la α-amilasa).

1. Se prepara una dilución 1/50 del glucógeno disuelto anteriormente (0.1 mL en 5 mL de agua).

1. Se preparan tres tubos de ensayo como se describe en la siguiente tabla:

1. Una vez preparados los tubos, se sumergen en un baño con agua hirviendo durante 5 minutos. Pasado este tiempo, se enfrían en un baño de hielo. (Precaución al coger los tubos. Usar pinzas).

1. Se mide la absorbancia a 620 nm ajustando a 0 con el tubo C (blanco).

 Investigar y contestar el siguiente cuestionario.

1.- ¿Cuál es la función del sulfato de sodio en la extracción?

2.- ¿Cuál es la reacción de la antrona con los azúcares?

3.- ¿En qué órganos del cuerpo humano ocurre la síntesis de glucógeno?

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