Fotocolorimetria

FOTOCOLORIMETRIA

I. INTRODUCCIÓN:

La fotocolorimetría es un método que sirve para hallar concentraciones de diferentes muestras y para seguir el curso de una reacción en experimentos de cinética química o enzimática. La técnica consiste en medir la intensidad de luz absorbida (A) o transmitida (T) por una solución coloreada de uno o varios compuestos. La absorción máxima ocurre a una longitud de onda (λ) característica para cada compuesto y la intensidad de la energía absorbida a esa longitud de onda, varía proporcionalmente con la concentración del compuesto en una solución. El método parece estar restringido a las sustancias coloreadas, sin embargo también se puede extender a los compuestos incoloros, haciéndolos reaccionar con una especie que genere un producto coloreado. Absorción de energía por sustancias coloreadas

Una sustancia es coloreada porque absorbe y transmite radiación electromagnética en la región visible del espectro, es decir, entre 400 y 800 nm (λ). El color que se observa es una combinación de las longitudes de onda no absorbidas, y por lo tanto, transmitidas por la sustancia.

Una de las mediciones más frecuentes en bioquímica es la concentración de una sustancia y para su determinación se puede recurrir a dos métodos. Factor de calibración o curva de calibración .Esta última no siempre es correcta; es decir, sus puntos de intersección(X,Y)=(concentración, Absorbancia)no se encuentran coloniales, lo cual lleva a elaborar una curva irreal, no representativa de lo esperado.

La curva de calibración relaciona los datos de concentración contra sus respectivas absorbancias, por lo que se puede tomar como variable independiente las concentraciones (eje de las Y), siendo posible determinar la ecuación de la curva que se adapta mejor a los datos.

Y = a° + BX + E

a° = Verdadero valor de la intersección de la curva

B = Verdadero valor de la pendiente.

X,Y = X es una variable pre establecido o no aleatoria , se utiliza para hacer una predicción de Y.

E= Representa una variabilidad en toda medición causada por material de vidrio sucio, variación de temperatura, fluctuaciones eléctricas, variabilidad biológica, no linealidad, interferencias químicas, etc. Este valor no se toma en cuenta en la ecuación final por ser un valor constante.

Una de las consideraciones que se toma en cuenta un análisis de regresión lineal, es que para cualquier valor de X exactamente conocido, existen sendas distribuciones normales de valores de Y, quedando la ecuación reducida a:

Y = a + bx

“a” y “b” = son “coeficientes de regresión y reemplazan a a° y B respectivamente

Y = Denota el valor predecible de la media de Y para un valor dado de X.

Finalmente lo que interesa es determinar los “coeficientes de regresión”, aplicando el método de los “mínimos cuadrados”, luego hallar el valor de las nuevas lecturas aplicando:

Y = a + bx

II. OBJETIVOS

 Aprender a ajustar matemáticamente curvas de calibración con dispersión, como consecuencia de errores.

 Determinar el factor de calibración para cálculo de concentraciones.

III. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS

 EQUIPOS

 Espectrofotómetro

 MATERIALES Y REACTIVOS

 Soluciones a ensayar: sulfato de cobre, dicromato de potasio, rojo de metilo

 Tubos de ensayo

 Pipetas de 1 y 10 ml

IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

TUBOS (ml) I II III IV V VI

Reactivos(ml):

CuSO4 al 10%

KCrO2 al 0.1%

KMnO4 al 0.01%

---

1

2

3

4

5

Agua destilada(ml) 5 4 3 2 1 ---

Mezclar. Leer a 475nm, 500nm y 600nm cada reactivo.

V. RESULTADOS

Sol. Sulfato de Cobre (CuSO4):

TUBOS (ml) I II III IV V VI

D.O 475 0 0.002 0.003 0.003 0.008 0.005

500 0 0.003 0.004 0.005 0.010 0.010

600 0 0.062 0.123 0.182 0.252 0.322

Concentración 0 0,1g 0,2g 0,3g 0,4g 0,5g

Sol. Dicromato de potasio (KCrO2):

TUBOS (ml) I II III IV V VI

D.O 475 0 0.169 0.321 0.496 0.651 0.850

500 0 0.066 0.120 0.186 0.243 0.320

600 0 0.005 0.003 0.002 0.001 0.002

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