Fundamento De Temperatura De Enzima Tripsina

Fundamento:

La determinación del efecto de los diferentes valores de pH sobre la velocidad de reacción de la enzima tripsina, se realizará aplicando diferentes valores de pH, que luego se van a incubar, a una misma temperatura y con una misma concentración de la enzima, por un tiempo de 10 minutos, con un intervalo de tiempo determinado en la aplicación de cada tubo. De esa manera se deberán mantener los demás factores constantes, para que el único factor de variación en la actividad enzimática, sean los diferentes valores de pH.

De igual forma, la enzima tripsina se incubará por 10 minutos, a diferentes valores de temperatura, siempre con una cantidad constante de enzima, esto permitirá determinar el efecto de los diferentes valores de temperatura sobre la actividad enzimática de la tripsina.

La enzima empleada fue la tripsina porcina que es extraída del páncreas de porcino. Como se procedió anteriormente, se empleará al BAPNA como sustrato de la enzima, para medir la nitroanilida formada –coeficiente de extinción molar para la nitroanilida es 7760- haciendo las lecturas de absorbancia a 410 nm. De esta manera la velocidad de reacción se medirá cuantificando la cantidad de producto por minuto de reacción.

MATERIALES Y MÉTODOS

Equipos:

Equipo Función

Espectrofotómetro

Nos permite medir las absorbancias de las muestras y a partir de ella determinar las concentraciones a partir de intensidades de color en función de la longitud de onda.

Baño María (37ºC) Permite establecer la temperatura óptima para que se exprese la actividad enzimática que va a ser medida.

Vórtex Sirve para la homogenización de las muestras.

Pipetas Pipeta: para obtener alícuotas de volúmenes exactos de cada reactivo. Es menos exacta, peor es eficiente si se usa adecuadamente.

Micropipeta: para absorber y transferir pequeños volúmenes de líquidos. Es mucho más precisa pues cuenta hasta microlitros, ero es más sensible y su cuidado debe ser mayor.

Tubos de ensayo Nos sirve para depósitos de sustancias

Gradillas Para colocar los tubos y ordenarlos adecuadamente.

Parafilm Se usa para sellar los tubos de ensayo con la función de protegerlo de la humedad para el almacenamiento a largo plazo y para poder homogenizar la solución recién preparada.

Reactivos:

Buffer Triz 50mM, pH 8.2, 10mM en Cl2Ca Permite establecer un pH constante, para proporcionarle así el pH adecuado a la tripsina para que actúe. El Cl2Ca es importante para la actividad de la tripsina.

Solución Stock de tripsina Solución de tripsina a partir de la cual se hace una disolución. Esta se debe mantener en refrigeración y es estable por 7 días.

Solución estándar Se prepara mediante una disolución de la solución stock de tripsina. Se toman 2ml de la solución Stock y se agrega solución de

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