Fundamentos De Diferenciación De Gram Positivo Y Gram Negativo

Fundamentos de diferenciación de Gram positivo y Gram negativo

En general, las bacterias y otros microorganismos son transparentes, lo que dificulta su estudio cuando los exámenes se realizan en fresco. Por eso para distinguirlos del medio es necesario hacer una coloración (tinciones simples), las cuales también sirven para contrastar o realzar distintas características morfológicas o estructurales (tinciones diferenciales). La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por algún componente celular. Existen varios tipos de colorantes, pero los más usados en microbiología son: las sales colorantes y los colorantes liposolubles

Los fundamentos de la técnica se basan en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias Gram positivas y Gram negativas

Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tiñen de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la célula bacteriana sirve para dar su tamaño y forma al organismo así como para prevenir la lisis osmótica. El material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano. La pared de la célula gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectandas de peptidoglicano así como algo de ácido teicoico. Generalmente, 80%-90% de la pared de la célula gram-positiva es peptidoglicano. La pared de la célula gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho más delgada, únicamente de peptidoglicano y está rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolípidos, lipopolisacáridos, y lipoproteínas. Sólo 10% - 20% de la pared de la célula gram-negativa es peptidoglicano.

La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de peptidoglucano, además de dos clases de ácidos teicoicos: Anclado en la cara interna de la pared celular y unido a la membrana plasmática, se encuentra el ácido lipoteicoico, y más en la superficie, el ácido teicoico que está anclado solamente en el peptidoglucano (también conocido como mureína). Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada, y se encuentra unida a una segunda membrana plasmática exterior (de composición distinta a la interna) por medio de lipoproteínas. Tiene una capa delgada de peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipoproteínas. La membrana exterior está hecha de proteína, fosfolípido y lipopolisacárido.

Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tiñen diferencialmente debido a estas diferencias constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es el material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram positivas lo poseen en mucha mayor proporción que las Gram negativas.

La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloración, se debe a que la membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgánicos, como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglicano que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se formó previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdiéndose la coloración azul-violácea. Pero por el contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular más resistente y con mayor proporción de peptidoglicanos, no son susceptibles a la acción del solvente orgánico, sino que este actúa deshidratando los poros cerrándolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloración azul-violácea.

Tinciones

Para la observación microscópica existen diferentes tipos de coloraciones según las características morfológicas o estructuras que quieran ponerse de manifiesto. Se clasifican en simples y compuestas

TINCIÓN SIMPLE

Permite observar la forma, tamaño y agrupamiento de las bacterias usando un único colorante (normalmente básico).

Se entiende por tinción (o coloración) simple al teñido de los microorganismos aplicando sólo una solución colorante. Este tipo de tinciones pueden ser positivas o negativas.

La coloración positiva es la tinción de los microorganismos, efectuada con colorantes básicos que, como ya dijimos, poseen afinidad por los constituyentes celulares y se combinan químicamente con el citoplasma microbiano.

Técnica: La coloración consiste en cubrir el frotis, después de fijado, con la solución

colorante y se deja actuar el tiempo preciso. Luego se lava con agua y se deja secar.

•Con fucsina básica: se diluye 1/10 la solución de uso (fucsina fenicada de Ziehl) y se

deja actuar 30 a 60 segundos.

•Con violeta de genciana: se diluye al 1/10 la solución de uso y se deja actuar 30 a 60

segundos.

•Con azul de metileno: se cubre el preparado con la solución de uso (azul de metileno

alcalino de Loeffler) sin diluir y se deja actuar 3 a 5 minutos.

El azul de metileno es el colorante más débil de los tres, razón por la cual se usa más concentrado y se deja actuar durante más tiempo. También a la solución de azul de metileno de uso se le agrega un álcali (KOH) como intensificante,

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