Historia de la Microinyeccion

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Un poco de historia sobre la microinyección

Marshall Barber, quien desarrolló métodos para producir pipetas capilares de vidrio fino para aislar y manipular células bacterianas individuales, o al embriólogo Laurent Chabry, acreditado con desarrollando el microcapilar de vidrio y el micromanipulador como herramientas para sus estudios sobre teratología en blastómeros ascidianos. Barber incorporó técnicas a su método de inyección que todavía se usan hoy en día, incluido el primer uso de mercurio para controlar el movimiento de pequeños volúmenes de líquido y el uso de una segunda pipeta para sostener las células a medida que se completa la inyección.

La inyección con micro aguja de organismos como las amebas y embriones de ratón fue un campo de investigación en la década de 1960. Bueno si bien estos organismos facilitaron estudios biológicos clave en este período de tiempo, en los siguientes 10 a 15 años, los investigadores comenzaron a explorar la posibilidad de utilizar la microinyección para administrar orgánulos y moléculas a otras células como el paramecio, ovocitos y huevos de rana y ratón y células de mamíferos de origen somático.

La técnica de microinyección pasó de ser un método útil practicado por unos pocos científicos ingeniosos a una aplicación principal emocionante cuando Gurdon y sus colegas demostraron que el ARNm purificado de una célula podría inyectarse en el citoplasma de otra célula y, de hecho, traducirse en proteína. Esto fue notable por varias razones: el ARNm era estable, al menos lo suficientemente estable como para ser capaz de dirigir la síntesis de niveles detectables de proteína; no se requieren factores especiales, aparte del propio ARNm exógeno, para que esto funcione; y el éxito fue independiente del tipo de célula del ARN donante.

Equipo

Microscopio

Un buen microscopio invertido de contraste de fase es una herramienta fundamental para experimentos exitosos de microinyección. El microscopio debe contener una platina móvil manual o automática (dependiendo del aparato) con cubetas del tamaño apropiado para sujetar las placas celulares.

-Generador de presión de inyección

Una jeringa conectada por un tubo de teflón al soporte de la pipeta es el generador de presión de inyección positiva más simple. Sin embargo, este sistema no es tan fácil de usar como los generadores de presión automatizados disponibles comercialmente. Cada uno de estos sistemas puede combinarse con varios tipos de micromanipuladores.

Micromanipulador

Una amplia gama de micromanipuladores está disponible comercialmente. Dependiendo del estudio que se llevará a cabo, elija el que mejor se adapte a sus necesidades y presupuesto.

Sistema manual: este es el sistema más simple, y es muy útil y relativamente económico. Este sistema permite un control fino de la inyección de células individuales; sin embargo, el número de células inyectadas en cada experimento no puede ser tan alto como con el uso de un sistema automatizado. El sistema más simple está compuesto por una jeringa simple como generador de presión, conectada al soporte de la pipeta por un tubo flexible de teflón.

Sistemas semiautomáticos: este sistema todavía permite al operador controlar las inyecciones de células simples, pero es más rápido que el manual. El micromanipulador y la fuente de presión están conectados y automatizados.

inyección manual, y son más caros que los manuales.

Sistemas automáticos: los sistemas automáticos permiten al operador microinyectar más de mil células en un corto período de tiempo, pero el sistema es más complejo y algo más difícil de controlar en comparación con el manual o

sistemas semiautomáticos. Estos sistemas emplean posiciones controladas por computadora.

Estos son algunos ejemplos de organismos en los que se utiliza la microinyección

-Xenopus laevis

-paramecio,

-ovocitos

-células de mamíferos de origen somático

-mus musculus

-Embriones de Drosophila

-Zebrafish

-Pristionchus pacificus

-Nothobranchius furzeri

-Caenorhabditis elegans

- Heterorhabditis bacteriophora

- Branchiostoma belcheri

Sistemas de microinyección

Hay dos tipos comunes de sistemas de microinyección, uno de los cuales usa un flujo constante de muestra y el otro un flujo pulsado. El primero es muy simple y se puede lograr con un presupuesto relativamente bajo. En este método, se suministra un flujo constante de muestra desde la punta de la pipeta y la cantidad de muestra inyectada en la celda se determina por cuánto tiempo permanece la pipeta en la celda . Aunque esto significa que cada célula recibirá una cantidad de muestra ligeramente diferente, con la práctica, las microinyecciones pueden volverse altamente reproducibles. Un sistema típico está compuesto por un regulador de presión que se puede ajustar para dos presiones, contrapresión y presión de inyección , un soporte capilar y un micromanipulador grueso y fino por ejemplo, Narishige, Instrumentos de precisión mundial, Stoelting, etc. En este caso, utilizando un micromanipulador manual, la aguja se coloca por encima de la celda que se va a inyectar y se baja a la celda . A medida que se baja la aguja, la celda se deforma ligeramente porque la punta entra en ángulo. Debido a que la muestra fluye constantemente fuera de la aguja, esto puede no ser adecuado para muestras preciosas, aunque la experiencia muestra que incluso 5 ul de muestra es más que suficiente para inyectar 1000 células usando este método . El segundo tipo de sistema de microinyección utiliza un flujo pulsado. El sistema más común de este tipo que se utiliza actualmente es el inyector Eppendorf Femtojet junto con el Eppendorf InjectMan. La ventaja de estos sistemas es que hay mucho más control disponible sobre los parámetros de inyección y, por lo tanto, se reduce la variabilidad en las inyecciones. Otra buena característica de este sistema es la dinámica de la inyección en sí. La aguja se coloca sobre el sitio a inyectar y cuando se presiona un botón para inyectar, la aguja se tira hacia atrás en la dirección xy para permitir una inserción diagonal de la aguja en la celda, causando una perforación directa de la celda . Esto es rápido y puede causar menos daño a la célula.

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