Induccion De Celulas Pluripotentes

Utilización de Células iPS para

Tratamiento de Lesiones por Isquemia

Hipóxica en Cerebro de Ratón.

Barros, Gabriela y Gualano, Leonardo

INTRODUCCIÓN

Las células madre pluripotentes inducidas (iPS por sus siglas en inglés), son células reprogramadas

a partir de células somáticas (Takahashi y Yamanaka, 2006). En los últimos años ha tomado gran

impulso la investigación en torno a este tema, dada su potencial utilidad en terapia génica. El

hecho de que las células iPS puedan ser obtenidas en cualquier etapa de la vida de un individuo a

partir de células somáticas, les confieren una gran ventaja respecto de las células madre

embrionarias (ES), que sólo pueden ser conseguidas en las primeras etapas del desarrollo.

Se identificaron en trabajos previos, 4 factores esenciales para la reprogramación: Sox3, Oct3/4,

Klf4 y c-Myc (Takahashi y Yamanaka, 2006). Las iPS conseguidas en el presente trabajo fueron

obtenidas a partir de fibroblastos de ratón (MEF). Los factores de transcripción que juegan roles

importantes en el mantenimiento de las ES (Sox2 y Oct3/4), fueron expresados exógenamente a

través de la infección con retrovirus en los fibroblastos. También se expresaron de la misma

manera genes como c-Myc y Klf4, que demostraron estar implicados en la rápida proliferación de

los cultivos iPS.

Como parte del marco teórico del trabajo, aclaramos que Oct3/4 funciona como el enhancer de

dos genes muy activos durante el estadio pluripotente: Sox2 y Nanog. Oct3/4 (también conocida

como Pou5F1) está implicada en la auto-renovación de células madre embrionarias no

diferenciadas (Niwa et al.). La expresión de Oct3/4 debe estar estrechamente regulada, ya que una

concentración muy alta o muy baja hará que se produzca la diferenciación de las células.

Asimismo, Sox2 y Nanog están implicadas en la auto-renovación de las células madre. Estos dos

genes funcionan como activadores de Rex1 (Mitsui et at.). Sin embargo Sox2, ha demostrado ser

imprescindible en la reprogramación, mientras que Nanog, siempre que haya expresión de Sox2,

ha podido ser reemplazado (Yamanaka, 2006). La regulación de Rex1, es crítica en el

mantenimiento de un estado pluripotente. Cuando las células comienzan a diferenciarse, Rex1 es

abruptamente regulada a una expresión baja (Wang et al.).

Una vez evaluada y comprobada la pluripotencia de las células obtenidas, se las utilizó en pruebas

de tratamiento de ratones que presentaban daño cerebral debido a isquemia hipóxica (HI).

Se realizaron tres tratamientos con dos controles negativos, uno con lesión y otro sin ella. Los

ratones fueron separados en cuatro grupos aleatoriamente y se les asignó tratamiento también de

modo azaroso.

Ratones de la cepa C57BL/6J de nueve días de vida fueron sometidos a procedimiento quirúrgico.

A tres de los grupos se les produjeron lesiones por HI mediante obstrucción de la arteria carótida

(ver Materiales y Métodos). Al cuarto grupo solo se lo sometió a anestesia e incisión, sin

obstrucción de la arteria (Control).

Un primer grupo recibió tratamiento con iPS-MEF tres y diez días después de la injuria (iPS-MEF 3-

10). Un segundo grupo recibió tratamiento con iPS-MEF tres días después de la injuria y placebo

en el día diez ( iPS-MEF 3). Un tercer grupo fue inyectado al tercer y décimo día únicamente con

PBS como placebo ( iPS-MEF PL) al igual que el último grupo.

Se inyectó a todos los grupos BrdU a los 3, 4, y 5 días y EdU a los 10, 11 y 12 días, para poder

seguir la evolución, crecimiento y proliferación de las iPS-MEF.

Los resultados de los tratamientos fueron evaluados mediante estudios funcionales y técnicas de

inmunohistoquímica sobre los tejidos cerebrales.

Pudo evidenciarse una notoria mejoría en los ratones tratados con respecto a los no tratados. Las

diferencias entre los dos tratamientos con iPS-MEF no fueron notorias histológicamente, pero sí

se pudieron apreciar cambios a niveles funcionales.

Nuestro objetivo fue observar el efecto del tratamiento con células iPS en ratones con daño

cerebral causado por isquemia hipóxica.

MATERIALES Y MÉTODOS

CULTIVO CELULAR

Los fibroblastos aislados, fueron obtenidos de útero de ratón. Las células fueron cultivadas a 37 ºC

en medio PBS en placas. Cada 3 días fueron transferidas a nuevas placas con las mismas

condiciones anteriores.

INFECCIÓN RETROVIRAL

Un día antes de la infección, las células fueron plaqueadas en una cantidad de 8 x 10E6 células por

placa. Al día siguiente los vectores retrovirales fueron introducidos usando reactivo de

transfección Fugene 6, según recomendaciones del fabricante. Las células fueron incubadas

durante la noche a 37 ° C con 5% de CO2. Después de la infección, las células se volvieron a

sembrar en 10 ml de medio fresco. Tres días después de la infección, hemos añadido G418 a una

concentración final de 0,3 mg / ml. Los clones se seleccionan de 2 a 3 semanas.

CONSTRUCCIÓN DE LOS PLÁSMIDOS

Para generar los plásmidos se introdujo un casette rfA Gateway (Invitrogen) en el sitio de corte

EcoRI y XhoI. Las amplificaciones se hicieron por RT-PCR.

INMUNOSUPRESIÓN

Para favorecer la formación de teratomas, los ratones fueron inmunodeprimidos con ciclosporina.

La cilosporina se administró en una dosis de 50 mg/kg, y se administró vía intraperitoneal diluida

en aceite de oliva y distribuida en dos dosis diarias durante 7 días (Galván et al.).

FORMACIÓN DE TERATOMAS Y ANÁLISIS HISTOLÓGICO

Las células iPS se suspendieron a 1 x 10E7 células / ml en DMEM que contenía 10% de FBS. Los

ratones se anestesiaron con éter dietílico. Se les inyectó 100 ml de la suspensión celular (1 x 10E6

células) por vía subcutánea en el flanco dorsal. Cuatro semanas después de la inyección, los

tumores se diseccionaron quirúrgicamente de los ratones. Las muestras se pesaron, se fijaron en

PBS que contenía 4% de formaldehído, y embebidos en parafina. Las secciones fueron teñidas con

hematoxilina y eosina.

SECUENCIACIÓN GENÓMICA POR BISULFITO

El tratamiento de bisulfito se realizó usando el kit de modificación CpGenome (Chemicon) de

acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Los productos amplificados fueron clonados

dentro de pCR2.1-TOPO (Invitrogen).

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