Ingeniería enzimática

PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE UNA a AMILASA PRODUCIDA POR LA CEPA NATIVA Bacillus sp. BBM1

Torres Barajas Diego Esteban

Cortez Mendoza Anastasio

4BV3

Ingeniería enzimática

1. INTRODUCCIÓN

(EC 3.2.1.1) son enzimas que catalizan la hidrólisis de enlaces glicosídicos a­ 1,4 presentes en el almidón, glicógeno y otros polisacáridos. El almidón está compuesto por dos polímeros de glucosa: la amilosa, que presenta únicamente enlaces a-1,4 y la amilopectina, que adicional a los enlaces a­1,4, posee sitios de ramificación a­1,6. Para la conversión enzimática de almidones es necesario utilizar amilasas termoestables, ya que estas son adicionadas luego de un paso de gelatinización que requiere temperaturas entre 70 °C y 110 °C. El paso donde se adicionan las amilasas se conoce como licuefacción, y su objetivo es reducir la viscosidad de la solución mediante la hidrólisis parcial del almidón. Se ha estimado que las enzimas hidrolíticas del almidón representan cerca del 30% del mercado mundial de enzimas.

1. MATERIALES Y MÉTODOS

1. CARACTERIZACIÓN Y CULTIVO DEL MICROORGANISMO.

El microorganismo se aisló a partir de una muestra de suelo y se caracterizó bioquímicamente con la prueba API 50 CH (API, BioMerieux). La caracterización molecular del Bacillus sp. BBM1 se realizó mediante secuenciación del gen ribosomal 16S (16S ADNr). La amplificación de este gen se llevó a cabo mediante PCR, con los cebadores pA (5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’) y pC5B (5’TACCTTGTTACGACTT3’). La secuenciación del producto de PCR fue realizada por Macrogen Inc., Seul, Corea y depositada en GenBank con el código de acceso FJ411412. El crecimiento del microorganismo se llevó a cabo en medio de cultivo LB, suplementado con 1% de almidón soluble e inoculado con esporas previamente activadas (1% del volumen final del medio de cultivo), Las condiciones de crecimiento fueron 40°C y 180 rpm durante aproximadamente 60 horas. El extracto enzimático se obtuvo centrifugación por 20 minutos a 7000g.

1. PURIFICACIÓN DE LA A­AMILASA

La enzima se precipitó a partir del extracto enzimático mediante adición de sulfato de amonio hasta una saturación del 40%, incubación en hielo por 20 minutos y colectada por centrifugación (20 minutos a 7000g, 4°C).  El pellet se re suspendió en un volumen mínimo de tampón citrato (50 mM, pH 6.0) y se pasó a través de una columna Biogel P100 pre equilibrada con la solución de citrato. Se tomaron fracciones de 1 ml y se seleccionaron aquellas con actividad amilolítica. El grado de pureza fue evaluado mediante la relación actividad/ [Proteína total] y electroforesis en poliacrilamida 10% (SDSPAGE) [10]. La concentración de proteína fue estimada mediante el método de Bradford.

1. PRUEBA ENZIMÁTICA

Se tomaron 700 ml de solución de almidón soluble al 1% en tampón citrato (50 mM, pH 6.0), se adicionaron 100 ml de extracto enzimático y se incubó durante 45 minutos a la temperatura establecida. Para detener la reacción se tomaron 40 ml del extracto anterior y se adicionaron a 1 ml de HCl 0.1 N. A la mezcla anterior se le agregaron 40 ml de yodo de Gram y se midió la absorbancia a 660 nm. Como estándar se utilizó una curva patrón con almidón soluble sin enzima. Las unidades de actividad se definieron como el porcentaje de disminución en la absorbancia respecto al control negativo, así:  actividad = [pic 1]

1. CARACTERIZACIÓN DE LA ENZIMA

La temperatura óptima de la a-amilasa fue estimada mediante la prueba del lugol en un rango de temperaturas entre 30ºC y 90ºC en tampón citrato almidón 1% a pH 6.0. La termo estabilidad de la enzima se estimó mediante incubación del extracto crudo en un rango de temperaturas entre 30ºC y 90ºC por quince minutos y medición de la actividad residual. El pH óptimo de la a-amilasa fue determinado mediante medición de la actividad en un rango de acidez entre 2.0 y 13.0 utilizando los siguientes tampones:  BisTris/HCl (pH 5.5 7.0), Tris/HCl (pH 7.58.5) y glicina/NaOH (pH 8.510.5). El efecto de diferentes concentraciones de calcio y EDTA fue evaluado en buffer citrato suplementado con NaCl (50mM, 100mM, 200mM, 400mM y 800mM), CaCl2 (1mM, 10mM y 100mM) y EDTA (1mM, 10mM y 100mM). 

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