Inmunofluorescencia

Inmunofluorescencia

• Técnica de Ac fluorescentes o de inmunomarcación, es una técnica de biología molecular que incubar una muestra con un Ac que detecte la molécula o componente que queramos detectar. Dicho Ac lleva unida una molécula fluorescente (IFD) o bien, es reconocido por un segundo Ac marcado fluorescentemente (IFI).
• FUNDAMENTO: consiste en conjugar colorantes fluorescentes  (isotiocianato de fluoresceína o Tetrametil rodamina) con Ac (resultando un trazador sensible con radiactividad inmunitaria inalterada), exponiendo después este conjugado a los Ac o Ag correspondientes en cortes de tejidos, frotis de microorganismos o de células, o cultivo de tejidos en capa única. Cuando la reacción es positiva y luego se expone a una fuente de luz de onda corta (UV o azul) genera un fenómeno de fluorescencia en la molécula marcadora (se pone en evidencia el Ag en virtud del color brillante de los Ac) que a su vez emite luz a una longitud de onda más larga (verde, amarillo o naranja). Esta luz emitida puede ser cuantificada con facilidad por fotometría o en el caso de tratarse de preparados histológicos, o puede ser observada por medio de un microscopio de fluorescencia. En el caso de la utilización de la inmunofluorescencia como método de tinción para microscopía óptica, el fluorescente revela la localización a nivel celular o subcelular de la molécula diana.
• La primera técnica fue descrita en 1950 por Coons Y Kaplan y consiste en la técnica directa con Ac marcados, que proporciona la coloración de estructuras antigénicas por medio de Ac específicos  conjugados con un colorante fluorescente. Posteriormente, en 1954, se describió la técnica indirecta con Ac anti-Ig marcadas con fluorocromos.

Aplicaciones:

• En la actualidad se aplican en la investigación de gran cantidad de microorganismos (bacterias, espiroquetas, virus, hongos, levaduras y parásitos), para lo que se usa IFD, y en la determinación de Ac específicos  contra estos microoorganismos, en donde la IFI tiene mayor aplicación.
• Biopsia-----Como técnica de tinción, se utiliza en cortes de tejidos, líneas celulares cultivadas, células individuales y secreciones que contengan células en suspensión (por ejemplo esputo) con el fin de analizar la presencia y distribución de proteínas, glúcidos y moléculas pequeñas ya sean de origen biológico o no.
• Como técnica inmunoquímica de cuantificación, se emplea muestras biológicas y no biológicas, siempre que se encuentren en un medio favorable para la unión de los Ac. Se, se utiliza una solución PBS (Buffer fosfato salino) como medio de reacción. Ejemplo de este tipo de técnicas es la FPIA (Inmunoensayo de polarización fluorescente).
• En el estudio de la distribución intracelular de las moléculas.
• Detección de moléculas de complemento
• Cuantificación de inmunoglobulinas
• Diagnóstico de Enfermedades cutáneas
• Estimar la edad de variedad de muestras naturales.
• Diagnóstico de neoplasias

Tipos de inmunofluorescencia

Existen dos tipos de técnicas de inmunofluorescencia; primaria (o directa) y secundaria (o indirecta).[pic 1]

1. Primaria o IFD: hace uso de un único Ac que se encuentra químicamente unido a un fluoróforo. El Ac reconoce la molécula diana y se une a ella directamente. En el caso de utilizarse como técnica de tinción inmunohistoquímica, la región donde se deposita la molécula diana puede ser identificada al microscopio de fluorescencia como una zona brillante. Presenta algunas ventajas con respecto a la IFI (indirecta): Reduce el número de etapas necesarias, por lo tanto es más rápida y por otro lado es menos sensible a interferencias debidas a reactividad cruzada de los Ac o a reacciones no específicas, las cuales tienden a aumentar el ruido de fondo de la técnica. Esta técnica se vale de un anticuerpo primario marcado con un fluorocromo que reacciona con el antígeno dentro de la muestra. Es un procedimiento de un solo paso y comprende un solo anticuerpo marcado. La visualización de estructuras no es ideal a causa de la poca emisión de la señal. [pic 2]
2. Secundaria o IFI: hace uso de 2 Ac; el Ac primario es el que reconoce y se une a la molécula diana, mientras que el secundario que es el que se encuentra marcado con el fluoróforo, reconoce al primario y se une a él. Es un poco más compleja que la IFD, requiere más pasos y es más posible que sufra interferencias, pero en contrapartida es mucho más flexible que una técnica directa y debido a que es posible que un Ac primario una a más de un Ac secundario, implica un efecto de amplificación que también aumenta la sensibilidad de la técnica. Esta prueba tiene una sensibilidad mayor que los métodos directos y con frecuencia recibe el nombre de técnica del emparedado o de la capa doble. En vez de conjugar un fluorocromo con un anticuerpo específico dirigido contra el antígeno de interés, el fluorocromo se conjuga con un anticuerpo secundario dirigido contra el anticuerpo primario. [pic 3]

Por lo tanto, cuando la fluoresceína se conjuga directamente con el anticuerpo primario el método es directo y cuando la fluoresceína se conjuga con un anticuerpo secundario el método es indirecto.

El método indirecto aumenta en forma considerable la señal fluorescente emitida por el tejido.

• Esta técnica es posible, debido a que los Ac constan de 2 partes, una región variable (que es la que reconoce al Ag) y una región constante (que forma el esqueleto y estructura básica de la molécula de Ac). Es importante notar sin embargo, que esta división es artificial y que en realidad la molécula de Ac se encuentra formada por 4 cadenas polipeptídicas: 2 cadenas pesadas y 2 livianas, estas últimas son las que contienen la región variable.
• Es posible que existan varios Ac que reconozcan diferentes antígenos (es decir que tengan diferentes regiones variables) pero que compartan la misma región constante. Todos estos Ac con diferentes especificidades pueden ser reconocidos a su vez por un único Ac secundario que reconozca la región constante. Esto ahorra el esfuerzo técnico y el costo de modificar cada uno de los Ac primarios para acarrear el fluoróforo.
• Típicamente se hace uso de diferentes Ac primarios con diferentes regiones constantes generados por la estimulación en la producción de Ac en diferentes especies. Por ejemplo, un investigador puede estimular la producción de un determinado Ac primario en una cabra, y luego emplear un Ac de conejo que reconozca la región constante de los Ac de cabra (Ac de "conejo anti-cabra"). Y luego puede crear un segundo juego de Ac en ratón que sean reconocidos por un tipo diferente de Ac "burro anti-ratón". Esto permite reutilizar los Ac   bvmarcados, que son muy difíciles de obtener, en múltiples experimentos.

Clases de técnicas utilizadas para la preparación de las muestras

...