Inmunofluorescencia Assay.

IF (Inmunofluorescencia) Assay

Reposar los cubreobjetos en ácido sulfúrico 20% durante toda la noche; a la mañana siguiente lavar exhaustivamente con agua destilada estéril o solución inyectable (SSF) (al menos 10 veces).

(EN LA CAMPANA DEL CUARTO DE CULTIVO)

Secar entre papel filtro en una caja de Petri.

Colocar los cubreobjetos en la placa de 24 pocillos y añadir etanol al 95% durante 2 horas; realizar lavados con agua destilada estéril o PBS. Retirar el exceso de etanol con la bomba de vacío.

Realizar cosecha de células MCF10A de un cultivo a confluencia y colocar sobre los cubreobjetos en las placas multipozo de 24 10 µl de células en suspensión con medio DMEM 10% FBS, añadir 400-500 µl de DMEM 10% FBS y crecer 1 a 2 días hasta observar colonias de células con morfología epitelial (evitar que crezcan a confluencia alta).

Previo al estímulo, suprimir con medio basal durante 4 horas.

Realizar protocolo de estimulación planeado

Una vez concluido el tratamiento aspirar el medio (la placa puede ser manipulada fuera de la campana de flujo).

Añadir la solución fijadora y permeabilizadora (4% de paraformaldehido o formaldehido y 0.5% de Tritón X-100 en PBS) durante 15 minutos a RT. NOTA: mantener la solución fijadora almacenada a 4 º C por un lapso no mayor de 1 semana desde su preparación, atemperar durante 5 minutos previo a su uso.

Remover la solución F-P y realizar 3 lavados con (400-500 µl) una solución fría de PBS-Tween-20 al 0.05% (NOTA: mantener la solución PBS/T a 4 º C, estabilidad: 1 mes en refrigeración).

Añadir 250 µl de una solución 1M de glicina en PBS (para eliminar el exceso de paraformaldehido) durante 20 minutos a RT. (NOTA: la solución con glicina puede almacenarse a RT por 1 semana).

Realizar 3 lavados con (400-500 µl) una solución fría de PBS-Tween-20 al 0.05%.

NOTA: Despues de este paso, seleccionar solo los cubreobjetos a observar. Almacenar el resto en pbs a 4 º c durante una semana. Pasar los cobreobjetos a una nueva caja multipozo de 24 para su manipulación.

Bloquear durante 1 hora con 200 a 250 µl de una solución de BSA 3% a 4 º C (no es necesario rotar). NOTA: preparar solución de bloqueo nuevo en cada ensayo para mejores resultados; puede almacenarse a 4 º C por no más de una semana.

Remover la solución de bloqueo y añadir el anticuerpo primario a la dilución deseada en BSA 3%. Pueden añadirse de 150 a 250 µl de anticuerpo por pocillo o colocarlos “boca abajo” sobre un montaje de papel parafilm con 20 – 50 µl de anticuerpo. Incubar durante 2 horas a temperatura ambiente.

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