La Heparina

HEPARINA

RESUMEN: El presente estudio está destinado a establecer la etapa del proceso de fecundación en que la heparina ejerce el efecto estimulatorio de la fecundación en caprinos.

Oocitos bovinos fueron madurados en medio 199 y alternativamente utilizados para la producción de zonas pelúcidas solubilizadas o para estudios de fecundación. Las zonas pelúcidas, colectadas eliminando mecánicamente al oocito, fueron solubilizadas en ácido acético, liofilizadas y almacenadas a -20° C, hasta su reconstitución. Los espermatozoides fueron colectados con vagina artificial, lavados y capacitados por incubación en medio Talp con suero y heparina.

En el Experimento 1, los espermatozoides fueron suspendidos en Talp más heparina, Talp más heparina y zonas pelúcidas o en condiciones no capacitantes y fueron incubados por 90 min a 39° C y 5% de CO2 en aire. En el Experimento 2, los espermatozoides agrupados como en el experimento anterior fueron coincubados por 18 h con oocitos. En el Experimento 3, los espermatozoides fueron suspendidos en plasma seminal y Talp con y sin heparina e incubados por 90 min a los 0, 45 y 90 min, muestras de suspensión fueron expuestas a zonas solubilizadas e incubadas por otros 30 min. En los experimentos 1 y 3, el daño acrosomal fue evaluado usando la tinción PI/PSA y en el Experimento 2, la fecundación fue verificada por la presencia de pronúcleos y cola espermática en el oocito.

Los resultados en el Experimento 1 muestran que a los 90 min de incubación el daño acrosomal aumenta en los espermios tratados con zonas en relación a los controles (P< 0.001). En el Experimento 2. sólo hubo fecundación en los grupos espermáticos incubados en condiciones capacitantes. En el Experimento 3, los resultados muestran que el daño acrosomal aumenta ya a los 45 min de incubación (P<0.01).

Palabras claves: heparina, capacitación espermática, caprinos.

INTRODUCCION

La heparina ha demostrado mejorar la capacidad fecundante in vitro de espermatozoides de bovinos (Parrish y col., 1989), ovinos (Cox y col., 1992) y caprinos (Cox y col., 1995). En bovinos, la heparina facilita la capacitación espermática de espermatozoides eyaculados, uniéndose a residuos sulfatos (Miller y Ax, 1989) y probablemente removiendo factores decapacitantes adheridos a la membrana plasmática, tales comoproteínas fijadoras de calmodulina (Leclerc y col., 1992; Therien y col., 1995).

Para demostrar el efecto de la heparina en la capacitación espermática en bovinos, Parrish y col., (1989) utilizaron lisofosfatidilcolina, un lípido fusogénico capaz de desencadenar la reacción de acrosoma sólo en espermios capacitados. Más recientemente, Florman y col. (Florman y First, 1988; Florman y col., 1990) utilizaron zonas pelúcidas solubilizadas para evaluar el estado funcional de espermatozoides de bovinos. La solubilización de las zonas pelúcidas permite la liberación a la solución de ZP3, glicoproteína estructural de la zona pelúcida, responsable de la fijación espermática y de la inducción de la reacción de acrosoma a nivel de la zona pelúcida (Wassarman, 1987). Como sólo los espermios capacitados son capaces de ligar ZP3, la adición de zonas pelúcidas solubilizadas a preparaciones espermáticas en asociación con unaevaluación de la integridad acrosomal, constituye un modelo útil para la identificación fisiólogica del estado funcional de los espermatozoides.

En caprinos, la heparina aumenta la capacidad fecundante in vitro de los espermatozoides, siguiendo un patrón dosis-respuesta que se asemeja para los distintos machos (Cox y col., 1995). En el mismo estudio se mostró que el efecto en la capacidad fecundante toma un tiempo mínimo que se aproxima a una hora y que la eficiencia es influida por la actividad biológica de la heparina. El objetivo del presente trabajo fue precisar el efecto de la heparina en la función fecundante de los espermatozoides caprinos.

MATERIAL Y METODOS

Colección y maduración de oocitos. Ovarios de vacas fueron colectados en un matadero local y transportados al laboratorio en PBS a unos 35° C. Los complejos oocito-cúmulus (COC) fueron obtenidos aspirando folículos de 1-5 mm de diámetro con una aguja de 21 G conectada a una jeringa de 10 ml. Una vez lavados en Hepes-199 (Medio 199 con sales Earle y 20 mM de Hepes suplementado con 10% v/v de suero de oveja en estro y 75 µm/ml de kanamicina; pH 7.3), los COC fueron cultivados por 24 h en gotas de 50 µl bajo parafina líquida liviana, a 39° C y 5% de CO2 en aire humedecido. El medio de cultivo de maduración consistió en Medio 199 más 20% v/v de suero de oveja en estro, 2 µg/ml de insulina, 10 mM de Hepes y 75 µg/ml de kanamicina (pH 7.5).

Colección y procesamiento del semen. Semen de 4 chivatos sexualmente maduros fue colectado por vagina artificial, evaluado en función del movimiento progresivo en microscopia de contraste de fase y procesado para capacitación. La preparación espermática para capacitación in vitro fue llevada a cabo de acuerdo a Cox y col. (1994). En resumen, el semen fue lavado en medio Talp sin calcio (Talp-Ca libre) y los espermatozoides fueron recuperados por centrifugación a 300 g por 5 min e incubados a temperatura de laboratorio por 4 h.

Posteriormente, el semen fue lavado una vez más y la concentración espermática fue ajustada a 1.5 x 108 espermatozoides/ml utilizando Talp FIV (Medio Talp, con 10 µg de heparina, 2.7 mM de calcio y 10% v/v de suero caprino en estro tratado térmicamente), e incubado por 60 min a 39° C y 5% de CO2 en aire en una atmósfera humedecida. Luego, la concentración esper-má-tica fue ajustada a 50 x 106 espermatozoi-des/ml en los experimentos basados en la tinción espermática o 1.5 x 106 espermios/ml cuando hubo interacción entre gametos.

Fecundación in vitro. Después de la incubación, los COC fueron lavados 2 veces en Talp-Ca-libre y las células de la granulosa fueron completamente removidas pasando los COC a través de una pipeta fina. Posteriormente, los oocitos maduros fueron distribuidos al azar en las suspensiones espermáticas previamente preparadas. Sólo fueron utilizados oocitos con un cúmulus expandido y citoplasma granular y homogéneo.

Preparación de zonas pelúcidas solubilizadas. Oocitos de bovinos fueron colectados por aspiración de folículos de ovarios provenientes de mataderos, de acuerdo a Cox y col. (1994). Posteriormente fueron desnudados mecánicamente de células de la granulosa utilizando una pipeta Pasteur fina y las zonas pelúcidas fueron colectadas removiendo los oocitos con una pipeta con punta aguzada. Las zonas pelúcidas fueron lavadas y almacenadas a -196° C en medio HBS-PVP (10 mM Hepes, 140 mM NaCl, 0.4% de PVP-40; pH 7.4) con 10% de glicerol. Las zonas pelúcidas fueron solubilizadas

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