Laboratorio De Amilasa Salibal

ACTIVIDAD DE LA AMILASA SALIVAL

Ingeniería Ambiental

Objetivo:

Analizar el efecto del pH, la temperatura, los inhibidores y los activadores en la actividad enzimática de la amilasa

CUESTIONARIO:

En un cuadro muestre en cada experiencia con qué color se inició el proceso o reacción. Y en ese mismo cuadro muestre con qué color terminó la reacción

Explique los resultados obtenidos en el punto 7.1

En qué caso fue positiva la experiencia 7.2 y explique su respuesta

Cómo explica los resultados en el punto 7.3. explique su respuesta

En qué caso fue negativo la experiencia del punto 7.4 y cómo se explica esa negatividad

Dar dos conclusiones

Consultar 2 frases R y 2 frases S para la amilasa, el almidón y la sacarasa

RESPUESTAS Y DESARROLLO:

N° Tubo Enzimas Condiciones del experimento Sustrato Incubación

Color inicial Color final

1 Amilasa Enzima calentada previamente Almidón 10 min, 37ºC Incoloro Azul oscuro

2 Amilasa Enzima nativa Almidón 10 min, 37ºC Incoloro Incoloro

3 Amilasa Enzima nativa Almidón 10 min, 37ºC Incoloro Incoloro

Tabla No.1 Labilidad térmica de las enzimas

Los aumentos de temperatura aceleran las reacciones químicas: por cada 10ºC de incremento, la velocidad de reacción se duplica. Las reacciones catalizadas por enzimas siguen esta ley general. Sin embargo, al ser proteínas, a partir de cierta temperatura, se empiezan a desnaturalizar por el calor, tal como sucedió en la etapa A en el tubo N°1, en donde la enzima, se desnaturalizó a causa de la alta temperatura, perdió su actividad y no hidrolizó el sustrato. La temperatura a la cual la actividad catalítica es máxima se llama temperatura óptima. Por encima de esta temperatura, el aumento de velocidad de la reacción debido a la temperatura es contrarrestado por la pérdida de actividad catalítica debida a la desnaturalización térmica, y la actividad enzimática decrece rápidamente hasta anularse.

Al no hidrolizar el sustrato, el resultado final de la prueba es una coloración azul intenso. Este color se produce debido a que el Lugol reacciona con el almidón. El almidón en contacto con unas gotas de reactivo de Lugol (disolución de yodo y yoduro potásico) toma un color azul-violeta característico. El fundamento de esta prueba es la coloración producida por el Lugol que se debe a que el yodo se introduce entre las espiras de la molécula de almidón. No es por tanto, una verdadera reacción química, sino que se forma un compuesto de inclusión que modifica las propiedades físicas de esta molécula, apareciendo la coloración azul violeta.

El reactivo de Lugol es una mezcla acuosa de yodo (I2) y yoduro (I-), pues el yodo por sí solo no es soluble en agua, pero si hay yoduro, se solubiliza casi inmediatamente, por la formación del ion complejo triyoduro.

I2 (s) + I (-) (ac) <===> I3- (ac)

Cuando se adiciona triyoduro ("solución de yodo") a un polisacárido como el almidón, el yodo forma un complejo de adsorción.

Tabla N°2. Influencia del pH sobre la actividad enzimática de la amilasa

N° Tubo Enzima pH Sustrato Incubación Coloración final

1 Amilasa 5.0 Almidón 10 min, 37ºC Amarillo

2 Amilasa 6.8 Almidón 10 min, 37ºC Incoloro

3 Amilasa 8.0 Almidón 10 min, 37ºC Incoloro

Las enzimas tienen un pH óptimo o un intervalo de pH en el que su actividad es máxima. A valores inferiores o superiores de pH la actividad disminuye. Esto no es sorprendente dado que algunas cadenas laterales de aminoácidos pueden actuar como ácidos o bases débiles que desarrollan funciones críticas en el sitio activo de la enzima, que dependen de su mantenimiento en un cierto estado de ionización. Por otra parte las cadenas laterales ionizadas de la proteína pueden jugar un papel esencial en las interacciones que mantienen la estructura de la proteína.

Los resultados evidenciados en la prueba B muestran como un pH 5 (ácido) hace que la enzima lleve la hidrólisis del almidón hasta las eritrodextrosas ocasionando que la prueba con el lugol presente una coloración amarillenta. Este resultado indica una prueba positiva para el lugol. Esto quiere decir que la enzima no hidroliza completamente al almidón por el efecto que produce el pH, de lo contrario el resultado final sería incoloro, es decir, negativo para el lugol. De esta manera puede decirse que la enzima trabaja mejor a un pH básico.

Tabla N°3. Especificidad de las enzimas

N° Tubo Sustrato Enzima Inc. Lugol Reac.

Fehling

1

Almidón

Amilasa 10´ 37ºC

Incoloro

2

Almidón

Sacarasa 10´ 37ºC Azul oscuro

3

Sacarosa

Amilasa 10´ 37ºC

Incoloro

4

Sacarosa

Sacarasa 10 ‘, 37ºC

Naranja

Toda molécula de enzima posee un sitio activo, donde tiene lugar su acción catalítica. El concepto de sitio activo de una enzima corresponde a una depresión o hendidura relativamente pequeña que posee la geometría y distribución de cargas para unirse específicamente y en forma complementaria a un determinado sustrato, formándose así un complejo enzima-sustrato. Cabe señalar que, al separarse los productos de la enzima, esta última queda libre e intacta para catalizar la biosíntesis de nuevos productos iguales a los anteriores. Cada una de las enzimas cataliza una sola reacción química o en ciertos casos unas pocas reacciones íntimamente relacionadas, por la similitud molecular de los sustratos.

En la etapa C, el tubo N°1 tenía la enzima amilasa y su sustrato que es el almidón, razón por la cual la enzima actuó perfectamente sobre éste y en consecuencia la prueba resultó incolora, es decir, negativa para el lugol y positiva para la enzima, queriendo decir que la enzima hidrolizó completamente el almidón.

El tubo N°2 contenía almidón y sacarasa. En esta prueba la sacarasa no hidrolizó el almidón debido a que el almidón no es el sustrato para esta enzima, obteniendo como resultado una prueba positiva para el lugol y negativa para la enzima de color final azul oscuro.

En el tubo N°3 que contenía amilasa y sacarosa, la enzima no hidroliza al sustrato mostrándose en el resultado una solución incolora, negativa tanto para el reactivo de Fehlling como para la enzima, algo similar al resultado anterior, en donde la enzima no actúa porque no es el sustrato sobre

...