Fundamento | Combina la reacción del método Biuret con la reducción del reactivo de Folin-Ciocalteau por los grupos aromáticos de residuos de tirosina, triptófano, cisteína e histidina (Del Puerto, 2013).
Ensayo colorimétrico basado en la reducción de Cu2+ (cúprico) a Cu+ (cruproso) en pH alcalino, al reaccionar con los péptidos (grupo fenólico de tirosina e indol de triptófano).
Los grupos -OH reductores de los a.a. tirosina y triptófano, junto con los complejos Cu2+, reducen el reactivo de Folin generando un color azul.
| El colorante azul de Coomassie, en solución ácida, existe en dos formas: azul (forma aniónica) y rojo (forma catiónica). Su forma neutra es verde.
Es por eso que en condiciones ácidas cambiará de rojo a azul, debido a la unión de la proteína con el colorante, que forma un complejo no covalente fuerte con el carboxilo de la proteína, mediate fuerzas de van der Waals y atracciones electrostáticas. (Proteintech, 2020 y Fernández-Reyes et al.)
Las proteínas reaccionan con los grupos sulfónicos negativos de las moléculas de colorante rojo que ceden electrones a cadenas laterales positivas como lisina y arginina, desestabilizando la proteína, promoviendo interacciones de van der Waals, exponiendo residuos hidrofóbicos para formar un complejo estable con el colorante en su forma aniónica azul (Proteintech, 2020).
| Reacción colorimétrica basada en la reducción alcalina de iones de cobre divalentes a monovalentes, que son quelados por el ácido bicinconínico (BCA) y forman un complejo, pasando de verde a violeta. (Proteintech, 2020).
El ácido bicinconínico (sal sódica) es un compuesto capaz de formar un complejo púrpura intenso con iones de Cu+ en medio alcalino (pH 11.25) y forma la base para monitorizar el ión cuproso producido por la reacción entre proteínas y Cu2+ (Fernández-Reyes et al.). | Se basa en la formación de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces peptídicos en medio básico (NaOH o KOH) 1 molécula de Cu2+ se compleja con 4 -NH formando un complejo púrpura rojizo (Fernández-Reyes et al.)
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Aspectos importantes | - Rango de detección útil: 1 a 300 ug/ml (Copeland, 1994).
- La absorbancia del azul es a 540 nm o a 750 nm
- Ya que la mayoría de las proteínas contienen poco triptófano y cisteína, la coloración se debe mayormente al contenido de tirosina.
| - Rango de detección útil: menor o igual a 25 ug/ml o 200 a 1400 ug/ml (Copeland, 1994).
- Pico de absorción azul a 595 nm (Proteintech, 2020).
- La coloración es proporcional a la cantidad de proteínas (Proteintech, 2020).
- Se utiliza azul brillante de Coomassie G250, compuesto por trifenilmetano (Proteintech, 2020).
- Reconoce Arg, Phe, Trp, Pro, por lo que la reacción que tiene lugar depende de la composición de aminoácidos de la proteína de la muestra (Del Puerto, 2013).
| - Los enlaces peptídicos de las proteínas provocan la reducción, por lo que la cantidad de Cu+ será proporcional a la cantidad de proteínas (Proteintech, 2020).
- La absorción de luz de la solución violeta es a 562 nm (Proteintech, 2020).
- Aminoácidos aromáticos
| - Rango de detección útil: 0.5 a 80 mg/ml (Copeland, 1994).
- El reactivo empleado es el sulfato de cobre alcalino
- La absorbancia se mide a 550 nm contra curva estándar de BSA (albúmina de suero bovino)
- Si el reactivo biuret, preparado o comprado, presenta signos de precipitación, debe desecharse (Copeland, 1994).
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Ventajas | - Es sensible ante unos pocos microgramos.
- Determinación absoluta rigurosa en casi todas las circunstancias en las que se utilizan mezclas o extractos de proteínas crudas (Waterborg, et al,1994).
| - El equipo requerido no es caro (Proteintech, 2020).
- Consta de 1 solo paso (Proteintech, 2020).
- Es más fácil de usarse en comparación con el método Biuret, Lowry y BCA.
- Relativamente insensible a las interferencias que se presentan en los ensayos Lowry y Biuret (Copeland, 1994).
- Muy sensible: 1-15 ug (Fernández-Reyes)
| - Altamente sensible
- Rango de detección amplio (20-2,000 ug/mL)
- Simple y rápido
- El equipo necesario no es caro (Proteintech, 2020).
- Es el más sensible y muestra menos interferencias (Fernández-Reyes et al).
| - Útil para obtener una estimación de la concentración de proteínas en un rango bastante amplio, de manera rápida y sencilla.
- Bastante específico para proteínas (Fernández-Reyes et al).
- Es barato (Fernández-Reyes et al)
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Desventajas | - La sensibilidad va a variar entre las proteínas por el contenido de los aminoácidos ya mencionados.
- Muestra muchas interferencias con agentes quelantes de cobre, como detergentes no iónicos, EDTA, sulfato de amonio, etc. (Copeland, 1994 y Fernández-Reyes et al.).
| - Requiere una cantidad significativa de muestra (Proteintech, 2020).
- Entre las sustancias que interfieren están los detergentes y las soluciones básicas.
- No es útil para proteínas con una cantidad de aminoácidos muy por encima o por debajo del promedio. (Proteintech, 2020).
| - Pudieran interferir agentes reductores y quelantes (como EDTA) (Proteintech, 2020).
| - Tiene una sensibilidad muy baja (relativamente insensible), por lo que sólo se recomienda para la cuantificación de proteínas en preparados muy concentrados (como suero) (Fernández-Reyes et al).
- Los agentes quelantes de cobre pueden interferir (como EDTA) (Copeland, 1994).
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