OBSERVACION DE EFECTOS RELACIONADOS CON LA FOTOSINTESIS

PRÁCTICA No 7. OBSERVACION DE EFECTOS RELACIONADOS CON LA FOTOSINTESIS

Turizo Araque Valeria,  Fernández Zabala Sebastián

Universidad Nacional de Colombia, Facultad de ciencias, Laboratorio de bioquímica

Resumen

La fotosíntesis es el origen de la mayor parte de la energía de la biosfera y se encarga de la fijación del CO2 y de la producción de prácticamente la totalidad del O2 en la atmósfera, a la par que produce el alimento que sostiene la vida en el planeta. El proceso, que ocurre en los cloroplastos de las plantas y algas superiores, comprende dos fases independientes: la fase lumínica que se realiza en la membrana de los tilacoides, y la fase oscura que ocurre en los estromas del cloroplasto. Como reacción neta de la fotosíntesis. Se familiarizaron los conceptos y metodología de la producción de cloroplastos se comprobó la formación del poder reductor en la etapa lumínica de la fotosíntesis.  Se licuaron las hojas de acelga o espinaca y luego de un filtrado con gasa se centrifugaron hasta obtener los cloroplastos lo más puros posibles.  Se pudo notar como la luz hace efecto rápidamente en los cloroplastos para llevar a cabo la reacción de fotosíntesis.

Palabras clave: Máximo cinco y  que no se incluyan en el título del trabajo.

Introducción

El Cloroplasto es un orgánulo ovoide de las células verdes contenidas en los vegetales, que posee clorofila, gracias a la cual se puede llevar a cabo el proceso de fotosíntesis. (1) La fotosíntesis es el único mecanismo de entrada de energía para la biosfera (con excepción de los procesos que realizan algunas bacterias quimio-sintéticas que obtienen energía de la oxidación de sustratos inorgánicos), esta incluye reacciones de óxido-reducción. Básicamente en el proceso de oxidación la molécula de agua libera electrones con producción de oxígeno y la reducción del dióxido de carbono para formar carbohidratos  (2) La fotosíntesis es un proceso endergónico porque se necesita la participación de la energía radiante del sol para iniciar la cadena de reacciones que llevan a la formación de los compuestos orgánicos que almacena el organismo. La fase luminosa es la primera etapa de la fotosíntesis, y convierte la energía solar en energía química. La luz es absorbida por complejos formados por clorofilas y proteínas llamados fotosistemas, que se ubican en los cloroplastos. Se denomina fase luminosa o clara, ya que al utilizar la energía lumínica sólo puede llevarse a cabo en condiciones de alta luminosidad, ya sea natural o artificial. En condiciones de oscuridad, esta fase no tiene lugar.  (3).

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Imagen 1. Esquema de la fase luminosa de la fotosíntesis (4).

La fase oscura de la fotosíntesis son un conjunto de reacciones independientes de la luz que convierten el dióxido de carbono, el oxígeno y el Hidrógeno en glucosa. Estas reacciones, a diferencia de las reacciones lumínicas (fase luminosa o fase clara), no requieren la luz para producirse (de ahí el nombre de

Reacciones oscuras). Estas reacciones toman los productos de la fase luminosa (principalmente el ATP y NADPH) y realizan más procesos químicos sobre ellos. Las reacciones oscuras son dos: la fijación del carbono y el ciclo de Calvin. (5)

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Imagen 2. Esquema de la fase oscura de la fotosíntesis, ciclo de Calvin (6)

En la siguiente práctica se preparó una solución de cloroplastos, obtenidos de una planta de acelga previamente licuada y centrifugada, posteriormente se colocaron 6 tubos de ensayo a la oscuridad con solución de cloroplastos, solución de preparación y 2,6-Diclorofenolindofenol a diferentes concentraciones para cada tubo y se midió la absorbancia de las 6 muestras, tomando el tubo número uno como el blanco. Se procedió a poner los 6 tubos durante 45 minutos a radiación de luz emitida por un bombillo y se volvió a medir su absorbancia. Se realizó el mismo procedimiento con 4 tubos de ensayo dos a la oscuridad y dos a la luz el tubo dos y tres con 2,6-Diclorofenolindofenol, se procedió a medir la absorbancia para cada tubo  y posteriormente se sometieron a una radiación de luz emitida por un bombillo durante 45 minutos y se volvió a medir la absorbancia de las 4 muestras.

El objetivo de la práctica es conocer la metodología adecuada para aislar cloroplastos y comprobar la formación de poder reductor de la fotosíntesis en la etapa luminosa.

MATERIALES

-Un bombillo de 100 W, centrífuga, 500 gramos de hojas frescas de espinacas o acelgas, hielo picado, licuadora, gasa, papel aluminio.

-Solución de preparación de cloroplastos: se preparó 100 ml de una solución con los siguientes componentes: Tris 20mM (pH = 7.8), KCl 40 mM, sacarosa 4 mM.

-Solución de lavado de cloroplastos: se preparó  100 mL de solución con estos componentes: KCl 40 mM (pH = 7.8), sacarosa 4 mM, MgCl2 2 mM.

-2,6-Diclorofenolindofenol (PM=326,09 g/mol) (DCFIF) 0.01%.

PROCEDIMIENTO

1. PREPARACION DE CLOROPLASTOS.

1.1 Se licuo a velocidad máxima y durante 15 segundos 50 gramos de hojas frescas de espinacas o acelgas en 75 ml de la solución de preparación de cloroplastos.

1.2 Se filtró el material licuado a través de una gasa pre-enfriada. Se recogió el filtrado en tubos de centrifuga llenándolos hasta sus 2/3 partes

1.3 Se centrifugo el material a 2500 rpm durante 10 minutos. Se descartó el sobrenadante cuidadosamente y se conservó el precipitado.

1.4  En un beaker con 30 mL de la solución de lavado se resuspendió allí suavemente el precipitado obtenido de todos los tubos. Se centrifugó nuevamente a 2500 rpm durante 5 minutos.

1.5 Se descartó el sobrenadante y conserve el precipitado. Se repite el lavado del precipitado dos veces más (del numeral 1.4).

1.6 Se resuspendió el precipitado en 40 mL de la solución de lavado, se tapó con papel aluminio, y se marcó como “Solución de cloroplastos” y  se conservó en un baño con hielo.

2. CURVA DE CALIBRACION

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