PRÁCTICA No 2: DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE LOWRY Y EL MÉTODO DE BRADFORD

[pic 1][pic 2]

INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS

INGENIERÍA BIOQUÍMICA

LABORATORIO DE MÉTODOS DE ANALISIS

PORFESOR: CAROLINA

GRUPO: 4IM2

NOMBRE DEL ALUMNO: PAOLA MARTÍNEZ ROSSETE

PRÁCTICA No 2: DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE LOWRY Y EL MÉTODO DE BRADFORD

SECCIÓN No 3

OBJETIVOS:

1. Elaborar una curva de calibración para la cuantificación de proteínas empleando un método fotométrico.
2. Determinar si hay diferencia estadísticamente significativa en la precisión y la exactitud entre los métodos de Bradford y Lowry.
3. Conocer el efecto de sustancias no proteínicas en el desarrollo de color
4. Analizar las ventajas y desventajas del método de Lowry y Bradford, con respecto a otros métodos para la cuantificación de proteínas.

FUNDAMENTO:

El método de Lowry es uno de los métodos más empleados para determinar la cantidad de proteínas en una muestra, que está basado en la asociación de dos reacciones complementarias:

1. Reacción del Biuret: característica de grupos aminopeptídicos, con los que el Cu (II) en medio alcalino forma enlaces de coordinación, originando complejos de color violeta.

2. Reactivo de Folin-Ciocalteu: característica de grupos -OH reductores que, junto con los complejos cuproproteicos de la reacción del Biuret, reducen el reactivo de Folin, el cual vira a color azul oscuro.

El espectro de absorción del reactivo de Folin reducido presenta un máximo de absorción a 640nm y su intensidad es proporcional a la de proteínas que existe en la muestra

El método de Bradford se basa en utilizar un colorante hidrofóbico (comassie G-250) cuyas disoluciones acuosas en presencia de ácido fosfórico tienen un color pardo que al entrar en contacto con la parte hidrofóbica del interior de una proteína se fija.

Las proteínas se unen a la forma azul para formar un complejo  proteína-colorante con un coeficiente de extinción molar mayor que el colorante libre; a mayor cantidad de proteínas mayor es el color desarrollado y por lo tanto mayor será su absorbancia, es por ello que se considera un cromoforo exógeno

Éste método es sensible a los  restos de contaminantes tales como detergentes y líquidos orgánicos, para poder medir la absorbancia se construye una curva de calibración empleando una proteína patrón que generalmente es albumina que se lee a una longitud de onda de 595 nm

DATOS EXPERIMENTALES:

TABLA CURVA DE CALIBRACIÓN DE ALBÚMINA O HEMOGLOBINA, MÉTODO DE LOWRY

[pic 3]

CUESTIONARIO:

1.- Calcule lo valores de la pendiente, ordenada al origen y el coeficiente de correlación y diga cómo se interpretan para la curva de calibración

2.- ¿Cumple su curva con la Ley de Bouger y Beer? ¿Entre que límites de cantidad de proteína?

• Si la cumple ya que se muestra una tendencia lineal al momento de realizar nuestra curva de calibración, los puntos que se observan muy dispersos entre ellos son por errores determinados, es decir errores del analista.

3.- A partir de la recta ajustada por regresión lineal y la ecuación de la misma, obtenga la expresión matemática para calcular la cantidad de proteína

Ecuación de la recta:

[pic 4]

Despejamos a x para así saber la cantidad de proteína que hay en cada uno de los tubos

[pic 5]

ÁNALISIS ESTADÍSTICO

...