PRÁCTICA No. 5 ELABORACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

PRÁCTICA No. 5 ELABORACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

Fundamento:  

Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos, siendo los constituyentes habituales: agar, extractos, peptonas, fluidos corporales, sistemas amortiguadores, indicadores de pH, agentes reductores y agentes selectivos. En relación a su composición química los medios de cultivo pueden ser de dos tipos: definidos (sintéticos) y complejos (no sintéticos). Los medios de cultivo también son clasificados en base a su estado físico: líquidos (caldos), sólidos (agar: 1.5 – 2.0%)  y semisólidos (agar: 0.3 – 0.5%). En general, la preparación de un medio de cultivo se reduce simplemente a pesar la cantidad deseada del mismo y disolverla en agua destilada, siguiendo las instrucciones del fabricante. Antes de su esterilización, los medios líquidos en caldo se distribuyen en los recipientes adecuados (tubos o matraces);  si es un medio sólido, habitualmente se procede a fundir el agar antes de esterilizar, una vez fundido, se distribuye en caliente  en tubos o matraces (no en placas de Petri ) y se esteriliza.  

Actividades

1.- Después de determinar el volumen del medio de cultivo requerido, calcule y pese los gramos necesarios de medio de cultivo en un matraz Erlenmeyer.

2.- Adicione el volumen  exacto de agua destilada a pH 7 usando una probeta para medirla y colóquele una torunda de algodón con gasa al matraz.  

3.- Disuelva completamente el medio de cultivo agitándolo, caliente si es necesario (agares y medios semisólidos, calentar hasta que el medio corra libremente por las paredes del matraz).

4.- Deposite con pipeta el volumen de medio requerido en cada tubo y coloque su tapón a cada uno. (Si el tapón no es de algodón déjelo flojo).  

5.- Para esterilizar en autoclave  u olla de presión los medios en tubos y matraces, siga las indicaciones:

a.- Revise el nivel del agua en la autoclave u olla, que corresponda al requerido o bien reponga el volumen necesario de agua para alcanzar el nivel.

b.- Encienda la autoclave u olla de presión.

c.- Coloque los tubos con medio en canastilla metálica o en recipientes adecuados y deposítelos en la autoclave, junto con el resto de medios y materiales que se requiera esterilizar.

d.- Cierre la autoclave, cuidando de dejar abierta la salida del vapor, con la finalidad de eliminar el aire presente en el interior de la autoclave, el cual va a ser desplazado por el vapor generado.

e.- Cierre la válvula de salida de aire, cuando la salida del vapor sea continua.

f.- Vigile el incremento de la presión hasta alcanzar 15 libras, regule el calor para tratar de mantener a esta presión por 15 min.

g.- Después apague el equipo y deje que la presión baje hasta que el manómetro marque cero de presión. (No forzar a que baje la presión).

h.- Abra la válvula de salida de aire para expulsar el vapor restante.

i.- Abra el autoclave y retire el material y medios de cultivo, los tubos que sea necesario inclinar así déjelos enfriar, el agar en matraz si es necesario viértalo a las placas antes de que solidifique. (En un área desinfectada y frente a la flama del mechero).

j.- Revise la cinta testigo adherida al material, si cambio de color y coloque los  materiales en un lugar seguro y adecuado (desinfectado y libre de polvo).  

k.- Todos los  medios de cultivo ya fríos, colóquelos en una incubadora a 37ºC        por 24 h. para realizar la prueba de esterilidad.  

l.- Después de la prueba de esterilidad, revise sus medios,  no deben registrar crecimiento o turbidez ni contaminación alguna. También muéstrelos a su maestro como una evidencia de su práctica.      

Resultados y discusiones:          

Aquiahuatl Ramos menciona: que La esterilización es un método de eliminación total de todo tipo de organismo que asegura la ausencia absoluta de cualquier forma viviente. Una esterilización deficiente o manipulación incorrecta de materiales y medios de cultivo conlleva a contaminaciones, resultados erróneos o pérdida del material biológico. Por ello, se requieren buenas prácticas de laboratorio para su adecuado manejo. La esterilización por calor seco o húmedo son los métodos que se utilizan con mayor frecuencia en el Laboratorio de Microbiología. El calor seco destruye a los microorganismos por oxidación, por ejemplo, al exponerlos directamente a la flama de un mechero o en horno a 150-180°C durante 2 horas. Estos métodos se aplican en la esterilización de asas de inoculación y para todo tipo de material de vidrio y quirúrgico.

Conclusiones:            

Se realizó la preparación correcta del medio agar nutritivo hasta su esterilización por calor húmedo en la autoclave. Así como también se realizó la prueba de esterilizad con la cinta testigo. Se comprendio el fundamento indispesable sobre el uso de la autoclave como la preparación de medios de cultivo y su esterilización.

Literatura consultada:        

Aquiahuatl Ramos Ma. Volke Sepúlveda T. Prado Barragán L. Shirai Matsumoto K. Ramírez Vives F. Salazar Gonzales M. 2012. Manual de prácticas de laboratorio. Microbiología General. UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA UNIDAD IZTAPALAPA. Recuperado de:

http://www.izt.uam.mx/ceu/publicaciones/MMBG/files/manual_microbiologia_general.pdf 

PRÁCTICA No. 6  VERTIDO DE AGAR EN PLACA, DISPOSICIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO ESTÉRILES Y PRUEBA DE ESTERILIDAD

Fundamento:

Durante el vertido de agar a placas en el laboratorio de Microbiología, debemos reducir los riesgos de contaminación al máximo, por eso se recomienda trabajar con los materiales estériles y secos en un área desinfectada, sin corrientes de aire y cerca de la flama del mechero, o bien manipularlos en una cabina de siembra.  

Además es importante que el medio de cultivo (agar) se enfríe lo suficiente, para pasarlo a las placas evitando que se genere vapor en la tapa de la placa, que después se escurre sobre el agar, generando un medio con humedad el cual no es adecuado para obtener colonias microbianas aisladas. La manipulación incorrecta de materiales y medios de cultivo ya preparados y estériles , conlleva a la contaminación y obtención de resultados incorrectos, perdida de material biológico, mayor gasto de materiales, así como requerir de mayor tiempo para elaborar de nuevo dicho material; por eso es muy importante que siempre se trabaje aplicando las Buenas prácticas de laboratorio,  donde una muy importante es someter los medios de cultivo a prueba de esterilidad, para confirmar si realmente están completamente libres de microorganismos viables.  

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