Plásmido PBR322

UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NUEVO LEON

Facultad de Ciencias Biológicas

Licenciatura en Biotecnología Genómica

Nombre de la Materia: “Técnicas básicas de manipulación de ácidos nucleicos”

Nombre del trabajo: “Reporte de Investigación a partir de referencia en la Web o libros de texto”

Título del Trabajo: “Plásmido pBR322”

Nombre del Alumno: Perla Montoya Lorenzano

Grupo: 423

Fecha de entrega: San Nicolás de los Garza, N.L. a 21 de Febrero del 2013

¿Qué es un plásmido?

Los plásmidos son cadenas circulares de ADN que se encuentran fuera de los cromosomas de un organismo, y poseen mecanismos intrínsecos para su duplicación e interpretación por la maquinaria celular. Se llaman elementos móviles debido a que los organismos que los poseen pueden transferirlos de uno a otro, intercambiando así características genéticas determinadas tanto inherentes de ese organismo como adquiridas por manipulación técnica. Dichas características pueden ser benéficas para el organismo portador del plásmido, como resistencia a una sustancia ambiental dañina, como puede ser un antibiótico, o nocivas, como venenos celulares insertados por algunas levaduras en sus competidoras en medios naturales.

Los plásmidos, en la naturaleza, funcionan como un vehículo para la transferencia rápida de características de un organismo a otro de manera horizontal. Esto es, que no se requiere un evento reproductivo, que puede ser ineficiente o lento en algunos casos, para la transferencia de genes. Los plásmidos que se encuentran en bacterias y levaduras, pueden convertirse en herramientas para transferir genes de un organismo a otro, con la única restricción de que sea una bacteria o levadura.

Plásmido pBR322

El plásmido pBR322 es el primer plásmido artificial diseñado en 1977 por dos científicos mexicanos, Francisco Bolívar y Rodríguez en el laboratorio de Herbert Boyer en la Universidad de California en San Francisco. Aunque se basa en un andamiaje natural, le fueron agregados genes para realizar las funciones que el investigador requería. Lo verdaderamente innovador es la técnica utilizada para la introducción de genes en este plásmido, que es justo donde estriba el valor de la aportación de este investigador. Los genes que se encuentran en este plásmido, que son su riqueza informacional, son introducidos según un diseño del investigador usando técnicas de ingeniería genética, pudiendo obtener por esta vía productos tremendamente diferentes, partiendo del mismo original.

En el caso del pBR322, el plásmido posee un gen en particular de resistencia a la ampicilina. El plásmido diseñado en laboratorio por el doctor Bolívar le confiere a la célula portadora del plásmido la capacidad de crecer en un medio bacteriológico con dicho antibiótico. La elegancia del trabajo consistió en introducir el gen que se quería producir (en este caso el de insulina) en el interior del gen de resistencia a ampicilina, de tal manera que si el gen nuevo estaba presente, la bacteria perdería su capacidad de crecer en el medio con antibiótico y, por lo tanto, señalaría que es portadora del gen de interés. Esto es llamado selección negativa, porque se busca que la colonia de bacterias o levadura pierda una función; en este caso, la de resistir a la ampicilina. Este método permite al experimentador discernir entre las células que poseen el gen de insulina y las que no.

Datos del PBR322

El plásmido PBR 322 está formado por 4361pb, es el más ampliamente usado para clonar, es de pequeñas dimensiones y lleva los genes para la resistencia a los antibióticos ampicilina y tetraciclina, contiene un solo sitio de restricción. Diversas endonucleasas de restricción son usadas para introducir fragmentos de DNA, la inserción de este no desactiva la resistencia a los antibióticos. El gen de resistencia a la ampicilina es ß-lactamasa.

Partes del plásmido (sitios)

PstI en el interior del gen amp y sitios únicos de restricción para BamHI y SalI (ambas enzimas) en el interior del gen tet.

EcoRI es una enzima de restricción producida por el microorganismo Escherichia coli que posee una diana de restricción en ADN sobre la cual su actividad catalítica hidrolasa genera extremos cohesivos.

EcoRv es una endonucleasa de uso común que crea cortes. La enzima reconoce la secuencia de ADN de 6 bases:

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