Preparación Reactivos

Para prepara ½ Litro de tampón barbital a pH 8,6 (NO USAR AGUA DESTILADA NORMAL)

- Pesar: 6,4 gramos de ácido barbitúrico

- 64,5 mL de HCl (0,1 M)

- 350 mL H2O bidestilada.

- 50 mL NaOH (0,1 M)

Al H2O adicionar el ácido barbitúrico y revolver y lentamente adicionar el HCL en un vaso pp. Y después agregar la soda (NaOH), calentar hasta unos 60-70 grados (no +).

Seguir con la agitación hasta que se disuelva.

Lo dejas que alcance la tº ambiente y ajustar a pH (8,6). Se debe enfriar solo.

En caso de pasarte de 8,6 lo bajas con HCl 0,1 M. y en caso de bajarse ajustar con NaOH. OJO son pequeñas cantidades para ajustar ya que debe quedar espacio (volumen para enrasar con agua destilada posteriormente). Una vez ajustado el pH se traspasa todo el contenido a un matraz de aforo.

Finalmente, enrasar con H2O bidestilada a 500 mL.

Para prepara “stock” de anticuerpos anti IgAs.

Usar del refrigerador el tubo que dice -2 Agitar (vortex)

Extraer de dicho tubo 1 mL. y en otro tubo adicionar 9 mL de tampón barbital. Agitar (vortex). Dicho tubo debe rotularse como -3

Para preparar placas agar (inmunodifusion radial)

- Pesar 0,35 gramos de agarosa para electroforesis y 0,42 gramos de PEG 6000.

- Mezclar lo anterior en un vaso pp pequeño y adicionar 14 mL de tampón barbital.

- Calentar en el microondas por 10 segundos y agitar con varilla de vidrio.

- Luego calentar por períodos no superior de 5 seg. “hasta” disolver y observar “transparencia”.

- Cuando la temperatura sea igual o menor a 56°C se le adiciona al vaso 500 microlitros de “stock de anticuerpos anti IgAs preparado a -3”

- Revolver y verter rápidamente en placas de microbiología.

- Enfriar a temperatura ambiente por 10 minutos (semitapado) y posteriormente llevar al refrigerador (tapado) por 5 minutos.

- Finalmente hacer perforaciones (5) en cada placa.

Preparación de tinción de azul de Coomasie

- Pesar 5 gramos de Azul de Coomasie (en polvo)

- 450 mL de ácido acético

- 90 mL de metanol

- 1 Litro de agua destilada

Una vez preparada dicha solución se debe realizar lo siguiente una parte de la tinción preparada por dos partes de agua destilada. Ésta última preparación (diluida en agua) es la que los estudiantes ocuparán para teñir y NO LA CONCENTRADA.

Solución de lavado

- 450 mL de ácido acético

- 90 mL de metanol

- 1Litro de agua destilada

Procedimiento de tinción de las placas

- Lavar las placas con agua destilada para sacar las sales 4 veces, cada vez por un tiempo de unos 40 segundos aprox.

- Luego teñir con la solución de azul de Coomasie por 5 minutos.

- Lavar con solución de lavado 5 veces,

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