Principio del procedimiento genexpert MTB/RIF

PRINCIPIO DEL PROCEDIMIENTO GENEXPERT MTB/RIF

El ensayo Xpert MTB/RIF, es una plataforma de PCR en tiempo real automatizada, integrada y semicuantitativa, que usa la plataforma GeneXpert (Cepheid). Este examen identifica el Complejo Mycobacterium tuberculosis y a su vez detecta mutaciones más frecuentes en el gen rpoβ que están asociadas a la resistencia de rifampicina (RIF), directo de muestras de pacientes con síntomas de tuberculosis en menos de dos horas. Es decir, esta técnica reconoce a través de cinco sondas específicas a su diana en el gen de rpoβ, lo cual significa que MTB está presente y no hay resistencia a rifampicina. Cuando exista alguna mutación, algunas sondas no se unirán a su diana, pero otras sí lo harán, y esta situación significa que MTB está presente en la muestra y que tiene una resistencia genética a RIF. Finalmente, si ninguna de las sondas se une a su diana, significa que no se detectan bacterias del complejo MTB.

Esta plataforma contiene un sistema cerrado de biología molecular que usa cartuchos de plásticos desechables de un solo uso y que son independientes entre sí para el procedimiento de la prueba. Por lo tanto, se reduce al mínimo los riesgos de contaminación cruzada entre las muestras a procesar y con esto nos permite realizar una prueba de biología molecular con bajos requerimientos de bioseguridad e infraestructura.

Los cartuchos del GeneXpert MTB/RIF funciona como un mini laboratorio de biología molecular, en cuyo interior se llevan a cabo todos los pasos para efectuar la PCR en tiempo real (la liberación del ADN, la combinación con los reactivos, la amplificación y la detección a través de fluorescencia liberada por sondas específicas). Para lo cual, el cuerpo del cartucho se encuentra segmentado en distintas cámaras, las que contienen todas las soluciones y reactivos necesarios para la realización de la técnica.

En el tubo de PCR que se encuentra ubicado en la lengüeta del cartucho, se realiza la amplificación en tiempo real de la diana, es decir, de distintos segmentos de la región RDR del gen rpoβ.

El ensayo Xpert MTB/RIF contiene reactivos para la detección de MTB y la resistencia a RIF, así como un control de procesamiento de la muestra (SPC, por sus siglas en inglés) para controlar el procesamiento adecuado de las bacterias diana y detectar la presencia de inhibidores en la reacción PCR. El control de comprobación de la sonda (PCC, por sus siglas en inglés) comprueba la rehidratación de los reactivos, el llenado del tubo de PCR en el cartucho y la integridad de la sonda.

PROCESAMIENTO DE ESPUTO PARA EL EXAMEN GENEXPERT MTB/RIF EN TUBERCULOSIS

1. Preparación de muestra y cartucho Xpert MTB/RIF (30 Minutos)

• Preparación de muestra

• Recibir muestras de esputo, las cuales siempre deben mantener la cadena de frío entre 2°C y 8°C.
• Verificar los datos del paciente según orden médica y asignar un código para cada muestra. La codificación asignada debe estar en la orden médica, como en el recipiente que contiene la muestra.
• Estimar el volumen de la muestra en su recipiente y transferir al tubo de plástico de 15ml. Si en caso se tratase de un tejido, machacar y homogenizar previamente en un mortero con solución salina.
• Añadir el reactivo de la muestra en la proporción 2:1 al tubo de 15 ml.
• Tapar el tubo y agitar enérgicamente de 10 a 20 veces o colóquelo en el mezclador vórtex por 10 segundos.
• Incubar a temperatura ambiente durante un total de 15 minutos. Entre 5 y 10 minutos de iniciarse el periodo de incubación, agitar enérgicamente 10 a 20 veces o colóquelo de nuevo en el mezclador vórtex como mínimo durante 10 segundos.

• Preparación del cartucho Xpert MTB/RIF

• Rotular o colocar una etiqueta en el lado izquierdo o derecho de cada cartucho, luego quitar la tapa del cartucho Xpert.
• Aspire la muestra licuada hasta la línea de 2 ml de la pipeta pasteur de plástico o justo por encima de ella.
• Vacíe la pipeta en la cámara de la muestra del cartucho Xpert.
• A continuación coloque la tapa del cartucho Xpert.
• Colocar cada cartucho en una caja transportadora y llevar al equipo GeneXpert para su debido procesamiento.

• Utilización del sistema GeneXpert (120 minutos)

• Inicio de la prueba en el instrumento GeneXpert

• Conectar el equipo GeneXpert.
• Encender el ordenador (laptop).
• Iniciar sesión en Windows como usuario Cepheid y contraseña CPHD.
• Hacer doble clic en el ícono “GeneXpert” en el escritorio.
• Para poder iniciar el Software, hacer clic en “No” en el cuadro de diálogo “Gestión de Base de Datos” para empezar el día de trabajo.
• Hacer clic en “Check Status” para confirmar que todos los módulos estén disponibles.
• Hacer clic en “Create Test” e inmediatamente se abre una ventana pidiendo para escanear el código de barras del cartucho.
• Tomar el lector de barras y escanear el código de barras del cartucho manteniendo presionado el botón. También se puede introducir manualmente el código de barras escribiendo los números que aparecen en las dos líneas del cartucho.
• Después de haber escaneado el código de barras, aparecerá una ventana donde se introducirá el nombre de identificación del paciente, ID de la muestra. El módulo donde se coloca el cartucho se seleccionará automáticamente, o también se podrá seleccionar de acuerdo a un orden alfanumérico.

• Inserción del cartucho en los módulos GeneXpert

• Abra completamente la puerta del módulo elegido indicada por una luz verde parpadeante por encima del módulo seleccionado.
• Inserte el cartucho cuidadosamente con el código de barras hacia adelante.
• Al cerrar la puerta del módulo con el cartucho la prueba se iniciará automáticamente.

• Monitoreo del progreso de la prueba en el GeneXpert

• Vaya a “Check status”,  en donde podemos asegurar de que el software se ha actualizado de “loading” a “run”, lo que significa que se inició el proceso de prueba correctamente.
• También podemos visualizar en que ciclo va de PCR, tiempo restante hasta el final de la prueba y estado de la prueba.

• Visualización de resultados de la prueba

• Hacer clic en “Ver Resultados”.
• Para visualizar un resultado determinado hacer clic en “Ver Prueba”. Doble clic en la prueba que se requiere ver. Aquí se podrá encontrar la información sobre la prueba, el resultado del test y las curvas de PCR en Tiempo Real entre otras.

• Reporte de los resultados del ensayo Xpert MTB/RIF

• Para generar un archivo PDF con los resultados de la prueba, en la ventana Ver resultados, haga clic en el botón Informe, y se creará automáticamente un archivo PDF desde el programa Adobe Reader.
• El software, además, mostrará el cuadro de diálogo Informe de la prueba. Aquí se podrá seleccionar uno o varios informes de prueba seleccionando la casilla de verificación situada a la izquierda del informe o informes.
• Para exportar los resultados de la prueba a un archivo de valores separados por comas (.csv), en la ventana Ver resultados, haga clic en Exportar.
• Ingreso y análisis de resultados al sistema NetlabV2, verificar datos del paciente (nombres y apellidos correctos, DNI, centro de salud, lugar de procedencia, códigos, etc), así mismo realizar un análisis de los resultados de cada paciente antes del ingreso final de dichos resultados.
• Ingresar también los resultados en la base de datos EXCEL GENEXPERT 2022
• Enviar el reporte de resultados al encargado de verificación en el sistema Netlab V2 para la liberación de estos.

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