Producción biotecnológica de Dextrano a partir de Leuconostoc mesenteroides

Producción biotecnológica de Dextrano a partir de Leuconostoc mesenteroides[pic 1][pic 2]

Ana Diaz, Esteban Jaramillo, Sara Giraldo, Karla Restrepo (1)

Wilman Alcaraz (2)

(1) Estudiantes de Microbiología Industrial y Ambiental

(2) Docente de Biotecnología Industrial

Escuela de Microbiología, Universidad de Antioquia

INTRODUCCIÓN

En los últimos años la industrialización de la biomasa genera gran cantidad de desechos, lo cuales son dispuestos en rellenos sanitarios, zanjas o riberas de los ríos convirtiéndose en una fuente de contaminación ambiental. Con el objetivo de aminorar los impactos ambientales, costos en tratamientos, disposición de residuos se han desarrollado una serie de tecnologías para obtener productos biotecnológicos a partir de residuos agroindustriales. Un ejemplo de estos productos son los biopolímeros o polisacáridos entre los que encuentra el dextrano. (1)

El dextrano es un polisacárido de alto peso molecular, compuesto de unidades de D-glucosa unidos mediante enlaces glucosídicos α-(1-6) Figura 1.; son estructuralmente diversos y se caracterizan de acuerdo con el porcentaje, naturaleza y distribución de sus enlaces. El dextrano se produce generalmente en cultivos de bacterias lácticas como Streptococcus, Acetobacter o Leuconostoc y algunos hongos del género Penicillium (2);  en medios que contienen sacarosa como fuente de carbono; las células en crecimiento secretan una enzima inducible llamada dextransucrasa que convierte el exceso de sacarosa en dextrano y fructosa(3).

El dextrano sintetizado por Leuconostoc mesenteroides fue uno de los primeros biopolímeros producidos a escala industrial con varias aplicaciones en la biotecnología y medicina como sustitutos del plasma sanguíneo, tratamiento de la anemia por deficiencia de hierro, portadores de fármacos. (6)(4). En la industria alimentaria se utiliza el dextrano para preparar dulces que poseen una textura interior adecuada, mientras que la industria de la pintura, los éteres y ésteres mixtos de dextranos son usados como agentes lacantes. Además, determinadas columnas cromatográficas cuentan con dextranos como fase fija. Los dextranos  son útiles en diversas industrias debido a su inercia, estructura porosa y las propiedades gelificantes, también es neutro y soluble en agua, fácilmente filtrable, biocompatible, biodegradable y estable durante más de cinco años. (4)(5).

Los altos precios en los mercados internacionales convierten a estos productos en una línea importante de desarrollo, sobre todo si la materia prima a utilizar es un desecho; mundialmente la producción de extraño se acerca a 2000 toneladas al año y se vende en 100 dólares el kg. (6)

Inicialmente se comenzó a utilizar por la empresa Pharmacia Fine Chemicals, revolucionando la purificación y separación de macromoléculas (proteínas, ácidos nucleicos y polisacáridos). Comercialmente se conoce como Sephadex (Separación Pharmacia Dextran).

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Imagen 1. Presentación comercial del Dextrano

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Figura 1. Estructura química del dextrano.

2. BIOPROSPECCIÓN DE CEPAS, RUTA METABÓLICA Y MEDIO DE CULTIVO

2.2 Leuconostoc mesenteroides MICROORGANISMO PRODUCTOR DE DEXTRANO

Leuconostoc mesenteroides es una bacteria Gram positiva, quimioorganotrofa y microaerofilia  que se caracteriza por su capacidad para fermentar la lactosa y producir  ácido láctico. Su morfología es principalmente esférica y se encuentran en pares o cadenas cocos. La especie mesenteroides produce glucosiltransferasas extracelulares, las cuales sintetizan dextrano y polímeros afines por división de la sacarosa y transferencia del grupo glucosídico a la cadena inicial de polímero, liberando fructosa como subproducto de la síntesis. (6)

2.2 AISLAMIENTO

La bacteria láctica L. Mesenteroides, es aislada comúnmente de ensilados y leche, también de jugo de caña, pero esta matriz presenta mucha variedad microbiana,  por lo que es necesario aislar las colonias y seleccionarlas por sus diferencias morfológicas y diferencias microscópicas tales como coloración  Gram seguido de pruebas bioquímicas para su correcta identificación, las cuales tienen como resultado que: no utilizan citrato como única fuente de carbono y energía, no presentan movilidad, no producen indol y no convierten el nitrito en nitrato, catalasa y oxidasa negativa, crecimiento positivo en NaCl 3% y negativo en NaCl al 6.5% y 10%, fermentación de arabinosa, fructosa, glucosa, lactosa, maltosa, manitol, sacarosa al 5%, positivo para la hidrólisis de almidón. (7)

El mantenimiento de la cepa pura aislada se debe realizar en medio MRS y glicerol a -20°C.

2.3 SUSTRATO AGROINDUSTRIAL

Para la producción de dextrano se han utilizado sustratos agroindustriales como cáscaras de naranja, piña y bagazo de caña.

El sustrato agroindustrial que se propone para la elaboración del medio de cultivo es la cáscara de la naranja, debido a que esta contiene 38g/L de sacarosa (Tabla 1). Además, contiene minerales como calcio, fósforo, magnesio y potasio los cuales son necesarios en los medios de cultivos como elementos traza. La agroindustrialización de la naranja se concentra principalmente en la producción de jugos, cuyo proceso conlleva una generación considerable de desechos entre el 23 y 40% como cáscaras, pulpa y semillas, causando un problema ambiental en la disposición de los mismos (13).

MATERIA PRIMA

Tabla 1.Composición fisicoquímica de la materia prima utilizada (8).

3. BIORREACTOR PARA EL PROCESO FERMENTATIVO

La producción del polisacárido se realiza en un proceso aerobio  donde el reactor más adecuado es tanque agitado, garantizando así que Leuconostoc mesenteroides excrete el dextrano al medio, el cual adquiere cierto grado de viscosidad lo que interfiere negativamente con la transferencia de oxígeno y de nutrientes en el biorreactor.

Según trabajos realizados en la producción de Alginatos, Dextranos y Xantanos a valores de la temperatura que estén entre 29 y 34ºC y se ven favorecidos a altas concentraciones de oxígeno (6).

Se trabajará con un biorreactor de tanque agitado de 100 L fabricado en acero inoxidable, con un volumen efectivo de 60,4 L, ya que el crecimiento de este microorganismo se ve notablemente influenciado por la agitación, se mantendrá a 150 rpm, 30° C, en un rango de pH de 6.0 a 6.9 y a 0,5 vvm de aire, las cuales son condiciones favorables para la producción de dextrano y reducir el tiempo de fermentación. (6)

Además de contar con un sistema de suministro de aire para el proceso con caudalímetro y control automático de caudal, con filtro estéril de 0.2 um en línea de entrada de aire y control de presión automático del proceso. La aireación y mezclado son dos factores determinantes en la producción de polisacáridos sobre todo a gran escala en donde surgen dificultades que no son apreciables a nivel laboratorio, debido a que al incrementar el tamaño del equipo, cambia la relación superficie volumen y la presión hidrostática. Para el caso de algunos cultivos donde se producen polisacáridos, el uso combinado de impulsores de tipo axial y de agitadores de tipo turbina Rushton, proveen una adecuada transferencia de oxígeno, además de un excelente mezclado.  (9)

3.1 MODO DE OPERACIÓN

Para la producción de dextrano por Leuconostoc mesenteroides el modo de operación será continuo, en el cual se provee un medio de cultivo constante para el crecimiento de las células y para la formación del producto; en este modo el volumen se mantiene constante retirando una cantidad de fluido equivalente al que se agrega. Se operará de esta forma para asegurar que el medio en el biorreactor esté siempre a la concentración óptima dado que el fluido tiende a obtener consistencia viscosa y además se reporta que con este modo de operación se obtiene altas tasas de productividad. (10)

Sistemas de control de las variables del proceso

• Temperatura: Para mantener la temperatura se usará la chaqueta del biorreactor para la transferencia de calor, el proceso debe mantenerse en una rango de 29 a 34°C, la cual es un factor clave en la velocidad de crecimiento y productividad del microorganismo.
• Control del pH : Se utilizará un sensor con el fin de monitorear el pH que debe mantenerse cercano entre 6.0 y 6.9 y el cual será regulado con solución de NaOH a 1 M o HCL  por bombas peristálticas.
• Antiespumante: La formación de espuma en los procesos de fermentación aerobia es muy común y puede generar problemas en el proceso, además de proporcionar una vía de acceso a microorganismos contaminantes y un bloqueo de la salida de gases, para esto Se utilizará uno de los antiespumantes EROL™, BIOSPUMEX™o CLEROL™ de PMC Ouvrie, por su baja toxicidad, por ser estables al calor al momento de ser esterilizados y por qué no interfieren con los procesos metabólicos, además controlan la formación de espuma que ocurre frecuentemente.
• Agitación: Dado el crecimiento de Leuconostoc mesenteroides se requiere de una agitación constante de 150 rpm, con un agitador de potencia de agitación de 0.5 kW. Dicha agitación podrá aumentar o disminuir durante el tiempo de fermentación teniendo en cuenta las variaciones que se comiencen a desarrollar durante el proceso, por lo que dependiendo de la necesidad de una mayor agitación o menor se realiza el control de dicha variable, para lograr favorecer otras.

Análisis KLa

La velocidad de transferencia de oxígeno es afectado por varios factores químicos y físicos, que varían el valor del Kla, en nuestro caso una fermentación aerobia , el Kla depende en gran medida de las propiedades hidrodinámicas existentes alrededor de las burbujas y teniendo en cuenta que al aumentar el tiempo de fermentación aumenta también la viscosidad del medio por la formación del polisacárido, el kla va a disminuir, por lo que se hace necesario aumentar la velocidad de agitación  y/o operar el sistema en continuo.

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