Reacción De Transaminación Y Reconocimiento Por Medio De Cromatografía En Papel

Con esta práctica se pretendía realizar una reacción donde hubiera el paso reversible de un grupo α-amino de un aminoácido, al carbono α de un α-cetoácido, dicha reacción necesitó el uso de una enzima catalizadora llamada “Transaminasa” obtenida del extracto crudo de hígado de rata. Cabe señalar que esta reacción de “Transaminación” ocurre en hígado”.

Para realizar prácticamente esta reacción se hicieron dos preparaciones donde una sirvió como testigo para tener un punto de referencia con el cual comparar; la diferencia entre ambos tubos es que en el tubo testigo no se puso el α-cetoácido el cual fue: Ácido α-cetoglutárico, pero si contuvo a la enzima transaminasa y al aminoácido: Alanina, pero al ser que no contuvo un reactivo, la reacción no se pudo llevar acabo. Posteriormente a la preparación se dejaron reaccionar las soluciones para después detener la reacción con la adición de etanol, pues las enzimas al ser de naturaleza proteíca y el etanol modificó la constante dieléctrica del agua, estas precipitaron.

Con el fin de poder cuantificar cuanto producto se formó (Ácido Glutámico) con la reacción de Transaminación es que se realizó una cromatografía donde se pusieron una serie de muestras del ácido glutámico con diferentes concentraciones (5, 10, 15, 20 y 25 μl) y la muestra problema. Después de realizar el corrimiento con una mezcla de solventes polares el que duró 18 horas, se reveló con una solución de Ninhidrina en etanol al 5% pues esta mezcla indica la presencia de grupos α-amino libres, posteriormente con las manchas ya reveladas se realizó una curva tipo con ellas, recortándolas y eluyendo las muestras con Ninhidrina en butanol al 1%. Las muestras se pasaron completamente a la solución líquida gracias a la adición de acetona al 75% ya que por su polaridad la acetona generó una fuerza de arrastre sobre los compuestos que contenían las manchas del cromatograma.

Finalmente se leyeron las soluciones con concentración conocida de ácido glutámico en el espectrofotómetro para elaborar una curva de calibración donde se pudo interpolar el resultado obtenido de la lectura del problema, el cual fue de 0.205 de absorbancia, pero como se salía de la curva tipo es que se realizó una dilución 1:2 donde la lectura fue de 0.17 de absorbancia indicando una concentración de 0.291 μmol/ml de ácido glutámico.

Como lo que se buscaba conocer era cuanto producto se formaba es que se utilizaron las “Unidades de Transaminasa” que indican la cantidad de enzima necesaria para producir 1μmol de ácido glutámico por gramo de hígado en 1 hora de incubación, las cuales fueron de 293.93 UT.

...