Reparación Emparejamientos Incorrectos

Biología molecular

Detección de la actividad de la telomerasa en lesiones cervicales, mediante el Protocolo de Amplificación de Repeticiones Teloméricas (PART) no radiactivo [1]

INTRODUCCIÓN

La telomerasa está formada por dos componentes: ARN de la telomerasa (TER o TR RNA) y un componente proteico (TERT). En la mayor parte de los tejidos, la actividad telomerásica es inhibida poco después del nacimiento. Sin embargo, se supone que la telomerasa también participa en los procesos de inmortalización celular y proliferación indefinida de tumores. Se presume que la reactivación o sobrexpresión de la telomerasa en células humanas está dada por un mecanismo multifactorial complejo que regula sus componentes estructurales.

Una vía por la cual la telomerasa es activada es la expresión eficiente de la oncoproteína E6, de los VPH tipo 16 y 18 (de alto riesgo), en los queratinocitos humanos durante los periodos previos de inmortalización. E6 es una oncoproteína que se une al producto génico del gen supresor de tumor: p53 (proteína activada por la fosforilación de proteínas sensibles al daño del ADN), formando un complejo E6-p53 que es blanco posterior para la degradación, y provoca fallos en los mecanismos de proliferación y apoptosis. [2]

La capacidad oncogénica de ciertos tipos de VPH ha sido atribuida principalmente a la actuación de las proteínas virales E6 y E7. Sin embargo, se ha observado que la infección persistente por sí sola no constituye una causa suficiente para conferir tumorogenicidad, por lo que son requeridos factores adicionales al huésped. Actualmente, representa un desafío acertar la predicción y el grao de progresión del cáncer cervicouterino a través de eventos moleculares.

La detección de la  actividad telomerasa se ha propuesto como un amplio marcador de diagnóstico clínico y de pronóstico certero de una gran variedad de cánceres, incluidas sus lesiones precursoras. Dada la relación entre la actividad de la telomerasa y la presencia de tumores se ha empleado in vitro un ensayo basado en la PCR denominado Protocolo de Amplificación de Repeticiones Teloméricas (PART),en el que la telomerasa sintetiza productos de extensión telomérica que posteriormente sirven como templado para la subsecuentes amplificaciones.Esto, ha permitido incrementar la sensibilidad, rapidez y eficiencia de la detección específica de la telomerasa en una gran diversidad de lesiones malignas.

El objetivo del estudio fue determinar la actividad de la telomerasa a partir de muestras de exfoliado cervical mediante el PART no radioactivo y, así, establecer su asociación con lesiones cervicouterinas y VPH oncogénicos.

MATERIALES Y MÉTODOS

La muestra estuvo conformada por 32 mujeres de 25 a 60 años de edad, con o sin antecedentes de lesiones cervicales, que acudieron a la consulta ginecológica del Departamento de Especialidadesde la Clínica de Prevención del Cáncer, Sociedad Anticancerosa.

Durante el examen ginecológico de cada paciente, se tomaron dos muestras cervicales con hisopo estéril para realizar extendidos en láminas portaobjetos y colorear mediante la tinción de

Papanicolaou (frotis Pap), para analizar los mismos acorde al sistema Bethesda. Luego, se tomaron dos muestras de exfoliado cervical por la técnica del cepillado (Cytobrush), una para la detección del DNA de los VPH tipo 16 y 18 y otro para la detección de la AT; éstas fueron transportadas en buffer salino (PBS) 1X en frío. Las pacientes con signos clínicos sospechosos fueron examinados bajo colposcopía para determinar la realización del estudio histopatológico.

PROTOCOLO DE AMPLIFICACIÓN DE REPETICIONES TELOMÉRICAS (PART)

Se utilizó como control positivo (por expresar constitutivamente telomerasa) el extracto proteico de la línea celular inmortalizada derivada de la leucemia Jurkat J77.

Extracción de proteínas totales. Se realizó el lavado de una de las muestras de cada paciente con PBS 1X en frío. El botón celular fue resuspendido en  buffer de lisis CHAPS 1X (Intergen) (200 microlitros/10^5-10^6 células) tratado con inhibidor de RNasas 200 U/mL; posteriormente, se incubó en hielo por 30 minutos, se centrifugó a 12000 x g por 30 minutos a 4°C y el sobrenadante obtenido se dividió en alícuotas de 10 microlitros y se llevó a congelación a -80°C hasta su procesamiento. El ensayo de proteínas de Bradford es uno de varios métodos simples comúnmente utilizados para determinar la concentración total de proteínas de una muestra. El método se basa en la proporción de unión del colorante a las proteínas. Dentro de la gama lineal del ensayo(~ 5-25 mcg / ml), a mayor proteína presente, más reactivo se une. Además, el ensayo es colorimétrico ; como la proteína aumenta la concentración, el color de la muestra de ensayose vuelve más oscura.El colorante absorbe a 595 nm. La concentración de proteína de una muestra de ensayo se determina por comparación de una serie de estándares de proteínas conocidas para exhibir de forma reproducible un perfil de absorbancia lineal en este ensayo. [3]

Detección de la actividad de la telomerasa. Ante la presencia de telomerasa en las muestras de exfoliado, ocurre un primer paso en el que el componente ribonucleico de la enzima se une a un sustrato oligonucleótido sintético (Cebador TS), que se  extenderá dada la adición de  un número variado de hexanucleótidos o repeticiones teloméricas. Los sustratos extendidos por la enzima son amplificadospor PCR generándose una escalera de productos desde 50 pb con un incremento de 6 en

6. La mezcla de reacción producida fue colocada en un bloque del termociclador bajo las siguientes condiciones: una primera etapa de extensión del sustrato TS a 30°C por 30 minutos. Posteriormente, una etapa de 5 min a 94°C para inactivar la telomerasa y 31 ciclos de amplificación a 95°C por 45 s, 50°C por 45 s y un paso único de extensión a 72°C por 10 minutos. El producto amplificado se resolvió por electroforésis en un gel de poliacrilamida no desnaturalizada (sin urea) al 12% y se visualizó por tinción con nitrato de plata.

Detección del DNA proveniente de los VPH tipo 16 y 18. Se realizó la extracción de DNA a partir de la segunda muestra de exfoliado cervical de cada paciente. La integridad genómica fue verificada luego del proceso de extracción mediante detección de un fragmento de 110 pb del gen de Betaglobina humana. El DNA extraído fue sometido a los ensayos de detección específica de los VPH tipo 16 y 18 (120 172 pb, respectivamente) por medio de PCR utilizando cebadores específicos seleccionados a partir de regiones altamente conservadas del genoma viral (regiones e6 y e7). Como control positivo se incluyó una reacción que contenía como blanco plásmidos portadores del genoma de los VPH tipo 16 ó 18, según el caso. Los productos de amplificación se resolvieron electroforéticamente en un gel de agarosa al 2% y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio 0.01% en un transiluminador de luz ultravioleta.

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