SIMBIOSIS DE RIZOBIOS CON PLANTAS LEGUMINOSAS

PRÁCTICA No. 14

SIMBIOSIS DE RIZOBIOS CON PLANTAS LEGUMINOSAS

OBJETIVOS

El alumno experimentará la técnica de aislamiento de los rizobios a partir de nódulos de raíces de plantas leguminosas.

El estudiante diferenciará las características microscópicas de Rhizobium en forma de bacteroide, así como las características microscópicas y coloniales que presenta al crecer en el medio de cultivo.

METODOLOGÍA

Material

Tubos de ensayo con tapón de rosca estériles

Varillas de vidrio estériles

Vasos de precipitado de 50 o 100 mL.

Solución de hipoclorito de sodio al 3%

Agua destilada estéril en matraces Erlenmeyer de 250 mL

Placas con medio ELMA, unas con Rojo Congo y otras con Azul de Bromotimol

Microscopio compuesto

Papel seda

Papel estraza

Tijeras

Mecheros Bunsen o Fisher

Equipo de coloración Gram

CH3CH2OH de 96º GL

Asa microbiológica

Encendedor o cerillos

Plantas leguminosas con nódulos radicales

Procedimiento

- Las raíces se lavan abundantemente con agua de la llave, de las mismas se desprenden los nódulos sin lesionarlos, dejando una porción de raíz de cada lado del nódulo. Dentro de un tubo de ensayo con tapón de rosca estéril se coloca un sólo nódulo en hipoclorito de sodio al 3% durante 1 o 3 minutos, según sea su tamaño.

-A partir de este momento, se debe trabajar en condiciones asépticas.

-Dentro del mismo tubo, lavar el nódulo con agua destilada estéril por lo menos 7 veces para eliminar totalmente el antiséptico, escurrir el agua del último enjuague y triturar el nódulo con la ayuda de una varilla de vidrio estéril.

-Del triturado se toma una asada para hacer un frotis que se tiñe con la técnica de Gram para la observación de la forma de bacteroide.

-Del mismo triturado se toma otra asada que se siembra por estría cruzada sobre el medio Agar-Levadura-Manitol (ELMA) con indicador Rojo Congo y posteriormente el primo aislamiento se transfiere al medio que lleva el indicador Azul de Bromotimol.

-Incubar a 28ºC por 2 días para los rizobios de crecimiento rápido (Rhizobium) y de 6 a 8 días para los de crecimiento lento (Bradyrhizobium).

- Observar la morfología colonial en el medio de cultivo, así como la modificación del pH original en el medio con azul de bromotimol.

- Hacer un frotis de las colonias y teñirlo con la técnica de Gram y describir sus características microscópicas.

MEDIO DE CULTIVO

Agar-Extracto de Levadura-Manitol

Manitol                                         10     g

Extracto de levadura                                  1     g

K2HPO4                                          0.5  g

MgSO4. 7H2O                                          0.2  g

NaCl                                                  0.1  g

Rojo Congo (sol. acuosa 1:400)                10     mL

Agar                                                 18     g

Agua destilada                                1000 mL

pH                                                 6.8 – 7.0

Esterilizar 15 minutos a 115°C

Cuando al medio se le adiciona Azul de bromotimol (5 mL/L en solución alcohólica al 0.5%), no se adiciona el rojo Congo

REPORTE

1.- ¿A qué género pertenece la planta indicada por su profesor?

R = Acacia

2.- ¿Dónde habita la leguminosa estudiada?

R = Regiones tropicales y subtropicales del mundo. La mayor diversidad de especies se encuentra en África y Australia, las especies de Oceanía se representan como la parte dominante de la vegetación, especialmente en las zonas áridas y semiáridas.

3.- ¿Qué características presenta la leguminosa? Agregue fotografías de las partes de la planta (hojas, flores, frutos, raíz).

4.- ¿Qué características tienen los nódulos de la leguminosa estudiada? Agregue fotografías.

5.- ¿Existen diferencias morfológicas entre los bacteroides observados en los nódulos y la bacteria aislada? Agregue fotografías.

6.- ¿Qué características coloniales presentó el aislado obtenido?

7.- ¿Qué tipo de metabolito produjo la bacteria aislada? Acompañe su respuesta con una fotografía.

8.- ¿Qué costo representa para las leguminosas establecer la asociación simbiótico-mutualista con un rizobio?

R =

9.- ¿Qué beneficios obtiene el agricultor al inocular en campo a las leguminosas con rizobios compatibles?

R =

10.- Citas bibliográficas consultadas.

CUESTIONARIO DE LA PRÁCTICA No. 14: SIMBIOSIS DE RIZOBIOS CON PLANTAS LEGUMINOSAS

1.- Esquematice las partes de la planta del Acacia. Agregue fotografías (hojas, flores, frutos, raíz)

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