TRABAJO PRÁCTICO Nº1 TRANSFORMACIÓN Y CONJUGACIÓN

GENÉTICA BACTERIANA 2017

TRABAJO PRÁCTICO Nº1

TRANSFORMACIÓN Y CONJUGACIÓN

Objetivo: Observar dos formas de transferencia de material genético en bacterias: transformación y conjugación.

INTRODUCCIÓN:

A) Transformación

        La transformación es el proceso mediante el cual una bacteria toma ADN directamente del medio extracelular. Si el ADN adquirido transporta un gen determinado, entonces la bacteria aceptora será capaz de expresar esta nueva característica y por lo tanto se la denomina transformante.

Esta transferencia de material genético sólo puede lograrse si la bacteria aceptora se encuentra en un estado fisiológico particular, denominado “estado de competencia”. Este estado puede adquirirse naturalmente o inducirse a través de métodos físicos o químicos. La bacteria del suelo B. subtilis desarrolla competencia naturalmente durante la transición desde la fase de crecimiento exponencial a la estacionaria. En el laboratorio la adquisición de este estado se puede optimizar utilizando condiciones de crecimiento específicas: crecimiento en medio mínimo y procedimientos para privar a la célula de nutrientes. La bacteria Escherichia coli, por el contrario, no es capaz de desarrollar competencia natural y para poder captar ADN del medio se debe inducir dicho estado artificialmente. Los métodos más utilizados para inducir competencia son el tratamiento de las células con iones de calcio previo a la introducción del ADN o la electroporación, en la que la mezcla de ADN y bacterias es sometida a un campo eléctrico fuerte por un período de tiempo muy corto.

a) Transformación de B. subtilis

En este trabajo práctico se introducirá mediante transformación el plásmido pJM116 en la cepa B. subtilis JH642 (trpC2 pheA1).

[pic 1]

El plásmido pJM116 es capaz de replicarse en Escherichia coli gracias al origen de replicación (ori), pero es incapaz de hacerlo en B. subtilis, por lo que se lo denomina “plásmido suicida" para esta bacteria. Debido a esto, la información del plásmido sólo se mantendrá en las transformantes si se integra al genoma mediante recombinación homóloga. Dado que pJM116 transporta 2 regiones del gen amyE, la integración se produce en esta región (ver la figura). Como consecuencia, se inactiva el gen amyE de B. subtilis (involucrado en el metabolismo del almidón) y la cepa será entonces amy- (o sea, que ya no es capaz de degradar almidón). Durante el proceso, se integran además los genes cat (que otorga resistencia a cloranfenicol) y lacZ (β-galactosidasa). Las transformantes obtenidas serán entonces CmR y amy-. El plásmido posee además el marcador de resistencia bla (confiere resistencia a ampicilina) y sirve seleccionar cepas de E. coli que mantengan el plásmido.

[pic 2]

El plásmido pJM116 es muy utilizado para el estudio de regiones promotoras de genes. Los fragmentos de interés pueden insertarse en el sitio de múltiple clonado (MCS) ubicado entre los genes cat y lacZ. En este caso el gen lacZ actúa como reportero y permite analizar la expresión génica de la región promotora clonada.

b) Transformación de E. coli

        Se transformará la cepa de E. coli DH5α (cuya competencia ha sido inducida químicamente) con el plásmido pUC19. Este vector, de amplio uso en el laboratorio para el clonado de genes de interés (permite seleccionar los clones positivos mediante α complementación), es replicativo en E. coli y confiere resistencia a ampicilina (bla). Las cepas que reciban el plásmido serán reconocidas por su capacidad de crecer en presencia del antibiótico.

[pic 3]

B) Conjugación

La conjugación es el proceso mediante el cual el material genético es transferido directamente desde una bacteria dadora a otra aceptora. La bacteria que adquiere la información genética nueva se la denomina transconjugante. Para que este proceso ocurra se requiere que el dador posea un plásmido conjugativo. Estos plásmidos se replican en el citoplasma en sincronía con el cromosoma bacteriano o bien se integran al cromosoma y se replican como parte de éste.

En este trabajo práctico se utilizarán las cepas de Escherichia coli:

• XLI-blue (recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17, supE44, relA1, lac [F', proAB+, lacIq, lacZ Δ15::Tn10 (TetR)]
• MC4100 (supE44, ΔlacU169, hsdR17, gyrA96, relA1 thiΔ(lac-proAB) SmR

La cepa XL1-blue (dadora) posee el plásmido conjugativo F que transporta un marcador de resistencia a tetraciclina (TetR). La cepa aceptora MC4100, contiene en el cromosoma un gen de resistencia a estreptomicina (SmR) que sirve como marcador de contra selección.

MATERIALES

1. Transformación 

1. Transformación de B. subtilis:

SpC                                                                 SpII

1X T-base                                                        1X T-base

1 mM MgSO4                                                        3,5 mM MgSO4

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