TRABAJO PRÁCTICO N°5 ORGANIZACIÓN SUBCELULAR

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Universidad Andrés Bello

Facultad Ciencias de la Vida

Departamento de Ciencias Biológicas

                            Laboratorio de Biología Celular BIOL035

                              TRABAJO PRÁCTICO N°5

               ORGANIZACIÓN SUBCELULAR.

                                                                        Alumnos:

• Agustín Concha
• Francisca Cornejo
• Verónica Fuentes
• Catalina González

                                                                                                     Fecha de entrega:

• 4 / 06 / 2019

                                                                                                     Sección:

• 2

                                                                                                     Profesores:

• M. Victoria Lillo Carmona
• Giorgia Ugarte Marín  

INTRODUCCION:

La célula es la unidad básica compatible con la vida, de ella podemos clasificarla como procariontes y eucariontes, no obstante, esta terminología a grandes rasgos no es suficientes para comprender su estructura, organización y funcionamiento. Hace 300 años aproximadamente mediante un microscopio fue observado y definido por primera vez la terminología “célula” al observar las celdillas de un corcho (1), luego con el paso de los años y junto con la modernización del microscopio se empezó a visualizar componentes subcelulares llamados organelos (estructuras que se encuentran en el interior de la célula delimitada por una o dos membranas). Actualmente se conocen el núcleo, las mitocondrias, el retículo endoplasmático, los ribosomas, cloroplastos y entre otros.  Gracias al amplio estudio que existe de estos organelos podemos clasificarlos e identificarlos. Para obtener este tipo de clasificaciones se puede utilizar el “fraccionamiento celular” que básicamente consiste en visualizar o separar los componentes subcelulares (organelos) uno de los métodos utilizados es el centrifugado (1). Lo principal en este método es obtener una muestra que contenga células que serán procesadas para obtener en tubos que fueron sometidos a centrifugación y debido a las diferencias de tamaños y densidad de componentes a una cierta cantidad de RPM (revoluciones por minutos) se obtendrá un Pellet y un sobrenadante, en el pellet estarán los primeros organelos que debido a la fuerza de gravedad caerán al fondo y en el sobrenadante estarán aquellos que no “decantaron”, este sobrenadante se puede volver a someter a centrifugación para obtener otro pellet y otro sobrenadante que posteriormente puede volver a ocuparse (1). ¿Pero bastará solo con este procedimiento para distinguir estos organelos? A simple vista en un microscopio debido a su estructura puede no distinguirse un organelo de otro y para identificarlos es que se utilizan marcadores, que son un método que ocupa la tinción para mejorar los contrastes (color) de imagen en el microscopio que reacciona con alguna estructura celular debido a su composición química, un ejemplo de ello es el azul de tripan que hace más visible el núcleo de las células y las mitocondrias que son identificadas por la actividad de la enzima SDH (succinato deshidrogenasa) (2).

HIPOTESIS: La fracción mitocondrial es identificada por la actividad de la enzima Succinato Deshidrogenasa.

OBEJTIVOS:

• Aplicar la técnica de  fraccionamiento subcelular en un homogenizado de hígado de pollo.        
• Comprender los fundamentos de la técnica de centrifugación usada en el fraccionamiento subcelular.
• Identificar la presencia de mitocondrias a través de la reacción de la SDH en las fracciones.
• Observar microscópicamente los cambios de la muestra de fracción nuclear.

MATERIALES Y METODOS:

 En la primera actividad realizada, con el objetivo de aplicar la técnica de fraccionamiento subcelular se cortó en trozos  una muestra de hígado de pollo previamente lavado con suero fisiológico para la eliminación de la sangre, para realizar este procedimiento utilizamos  una pinza y tijera,  posteriormente la muestra se colocó en un vaso de precipitado y se homogenizo con el Ultra Turrax (homogeneizador mecánico) para luego filtrarlo a través de una gasa puesta sobre un embudo de vidrio al cual denominamos homogenizado crudo, el siguiente paso fue verter 10 ml de la muestra en un tubo eppdendorf de 1,5 ml rotulado con las siglas “HC”, de los cuales se extrajo 1 ml  con una pipeta  Pasteur que se vertió en otro tubo cónico para conservar en hielo y los 9 ml restantes  se sometieron al centrifugado  a 1000 RPM durante 15 minutos  a 4°C. Luego del tiempo transcurrido, se transfirió el sobrenadante 1(HC) a un nuevo tubo eppdendorf de 1,5 mL rotulado “FN” (fracción nuclear) y se resuspendió el pellet obtenido del sobrenadante 1 con una pipeta Pasteur y con 3 ml de suero fisiológico. Siguiendo los mismos pasos, el tubo “FN” fue sometido a centrifugación a 6000 RPM por 20 minutos a 4°C, luego de esto, el sobrenadante 2 obtenido se vertió en un nuevo tubo eppdendorf rotulado “Fmit” y su pellet fue resuspendido utilizando una pipeta Pasteur con 1 ml de suero fisiológico. Por último, el sobrenadante 2 se centrifugo también a 6000 RPM por 20 minutos a 4°C, con el cual se obtuvo un sobrenadante 3 rotulado “Fmic” (fracción microsomal) pero a diferencia del resto, no se resuspendió el pellet obtenido, tan solo se eliminó y se guardó este sobrenadante. Para la segunda actividad con el objetivo de observar microscópicamente las fracciones ,se utilizaron dos portaobjetos con sus respectivos cubre objetos, en el primer portaobjetos se colocó una gota de la suspensión de la fracción nuclear que se mantuvo  en hielo en la primera actividad, y sobre ella el cubreobjetos  y se observó bajo el microscopio con un objetivo 40x, luego se preparó una nueva muestra con una gota de la misma suspensión de núcleos pero antes de colocar el cubreobjetos se adiciono una gota de azul de tripan y posteriormente se observó bajo el microscopio con un objetivo de 40x. En la última actividad con el objetivo de determinar la presencia de mitocondrias a través de la reacción de SDH (succinato deshidrogenasa), se utilizaron 5 tubos de ensayo rotulados del 1 al 5, y los 4 tubos eppdendorf  de la primera actividad( HC, FN, Fmit, Fmic), en cada tubo de ensayo se agregó una gota de las muestras contenidas en los tubos eppdendorf y siguiente a esto se les agregó a cada tubo de ensayo una gota de succinato, una de azul de metileno, una  de agua destilada y por ultimo vaselina para que el oxígeno no reaccionara con la muestra,  siguiente a esto los 4 tubos de ensayos fueron puestos en una gradilla y llevados a el baño termorregulador sometidos a 37°C, finalmente se observó y registró los resultados.

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