UNIVERSIDAD AUTÓNOMA FACULTAD DE INGENIERÍA, PROGRAMA DE INGENIERÍA BIOMÉDICA PRACTICA DE LABORATORIO NO 2 . EXTRACCION DE ADN.

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA FACULTAD DE INGENIERÍA, PROGRAMA DE INGENIERÍA BIOMÉDICA PRACTICA DE LABORATORIO NO 2 . EXTRACCION DE ADN.

ARMANDOLUCUMI MORENO PH.D

1. INTRODUCCION

Las características de un organismo están especificadas en su información genética, la cual está representada como una secuencia de ácidos nucleicos, donde la suma total de esta secuencia es lo que conforma su genoma. Quizás de los procedimientos en biología molecular, el más básico es la purificación de ácidos nucleicos, en la forma de ADN o ARN. Por lo tanto se requieren métodos seguros para la separación de estos componentes de las células. Para lograr esto, se utilizan diversos métodos de extracción dependiendo del tipo de tejido a emplear, fresco, seco o congelado.

2. OBJETIVOS

2.1. Aislar ADN genómico a partir de una muestra de sangre periférica humana anticoagulada con EDTA.

2.2 Discutir los principios fundamentales que subyacen al aislamiento.

3. MARCO TEORICO

El primer paso en cualquier protocolo de separación es el rompimiento del material inicial, ya sea de origen viral, bacteriano, vegetal o animal. El método utilizado para romper la célula debe ser tan leve como sea posible con el fin de causar el menor daño posible al ADN. La lisis celular se puede hacer por acción mecánica, pulverizando el tejido con hielo seco o nitrógeno líquido, también se puede utilizar la degradación enzimática de la pared celular (si está presente) y lisis con detergentes de las membranas celulares. Seguido al rompimiento celular la mayoría de métodos involucran una desproteinización, lo cual se lleva a cabo con un solvente orgánico, seguido de una precipitación con isopropanol o etanol y posterior solubilización con agua o tampón. Existen diferentes técnicas para la extracción del ADN, aunque todas conservan el uso de los mismos principios y fundamentos. Para obtener ADN a partir de leucocitos totales (obtenidos de sangre periférica), células en cultivo, tejidos animales, vegetales, levaduras y bacterias; se usa generalmente una técnica de cuatro pasos secuenciales:

· El primer paso consiste en la lisis de las células y los núcleos.

· Luego, la separación del ADN a partir de sangre total involucra la lisis de eritrocitos, seguida por una lisis de leucocitos y de sus núcleos.

· Las proteínas celulares son entonces removidas por un paso de precipitación salina,

· Finalmente el ADN genómico es concentrado por precipitación con isopropanol.

El ADN purificado por medio de este proceso, está listo para ser utilizado en diferentes aplicaciones, las cuales involucran: amplificaciones (PCR), digestión con endonucleasas de restricción, Southern blot y Dot blot. Existen otras técnicas que permiten la obtención de ADN genómico a partir de muestras sólidas y líquidas, que permiten la separación simple, rápida, segura y eficiente del ADN. Esta separación se basa en la utilización del isotiocianato de guanidina, como solución de lisis celular, lo cual permite una precipitación selectiva del ADN con etanol y solubilización en agua o en 8 mM de NaOH. Este procedimiento se puede realizar en 30 minutos, recobrando un 70% a un 100% del ADN.

PRE- LABORATORIO

Diferentes métodos y tecnologías están disponibles en el mercado para realizar el aislamiento de DNA genómico. En términos generales la separación del DNA de los componentes celulares puede ser dividida en cuatro etapas:

a. Disrupción o alteración de la membrana

b. Lisis

c. Remoción de proteínas y contaminantes

d. Recuperación del DNA

Teniendo en cuenta el enunciado anterior responda:

_ Los pasos a y b son combinados. Se emplea un buffer de lisis que contiene principalmente EDTA y SDS. ¿Cuál es la función de estos dos reactivos dentro de este contexto?

_ ¿Qué tipo de enzima se emplea para realizar la remoción de proteínas?

_ La recuperación del DNA se puede realizar mediante diferentes métodos, los más comunes son: Salting-Out, extracción orgánica con fenolcloroformo, gradientes de densidad de cloruro de cesio, métodos basados en sílica-gel o resina quelante (Chelex). ¿Diga cuál es el principio de cada uno de ellos?

3. MATERIALES Y REACTIVOS

• Tubos vacutainer con anticoagulante EDTA, heparina o citrato para obtención de sangre total (5 ml por mesa)
• Tubos Falcon de 15 mL y Eppendorf estériles de 1.5 mL
• Micro pipetas
• Puntas estériles
• Vortex
• Centrifuga con rotor para tubos de 15 mL y Micro centrifuga para viales de 1.5 mL
• Guantes
• Agua desionizada estéril
• Baño de agua a 37º C
• Isopropanol
• Etanol 70%
• Cloruro de amonio
• Bicarbonato de potasio
• EDTA
• SDS
• Acetato de amonio

4. PREPARACION DE REACTIVOS

4.1.Buffer de lisis de glóbulos rojos (100 mL):

• 0.83 g de Cloruro de Amonio
• 0.1g de Bicarbonato de Potasio
• 0.2 mL de EDTA 0.5 M pH 8.0
• 80 mL de agua destilada estéril

Mezclar en un erlenmeyer con magneto hasta homogenización completa.

...