Un enfoque radicalmente diferente para aumentar la estabilidad de una enzima es adoptar una estrategia evolutiva

Evolución

Un enfoque radicalmente diferente para aumentar la estabilidad de una enzima es adoptar una estrategia evolutiva. En este caso, la introducción de mutaciones en un gen diana en una base aleatoria es seguida por la selección de mutantes con las propiedades deseadas, que podrían incluir estabilidad mejorada, especificidad catalítica alterada o cualquier otro cambio en la propiedad que puede usarse como base para un gen Pantalla selectiva. La termoestabilidad mejorada de una 3-isopropilmalato deshidrogenasa mesófila de B. subtilis ha sido conseguida por Akanuma. Utilizaron un proceso escalonado de mutagénesis in vitro aleatoria seguida de selección in vivo en un huésped termófilo, Thermus thermophilus, para producir una triple enzima mutante con termoestabilidad mejorada y una actividad específica significativamente mayor que la del tipo salvaje; Sin embargo, este enfoque está limitado por su requerimiento de un huésped de expresión extremófilo con una deleción del gen huésped correspondiente. El sistema huésped de T. thermophilus está disponible, y otros sistemas termófilos de hospedador-vector están en desarrollo. En principio, se podría usar un enfoque similar para seleccionar enzimas mutantes con actividad mejorada bajo condiciones de alta sal o baja temperatura. Existen vectores de lanzadera adecuados para el huésped halófilo Haloferax volcanii, pero no se han descrito aún vectores de expresión para uso con un huésped psicrófilo.

Evolución dirigida

La evolución dirigida es un método que implica etapas secuenciales de mutagénesis aleatoria, recombinación y selección de mutantes con características deseadas, y no depende de la selección in vivo de mutantes en un hospedador extremófilo apropiado. En una revisión reciente del enfoque de evolución dirigida, Kuchner y Arnold presentan datos sobre la generación de una p-nitrobenzoil esterasa con termoestabilidad mejorada. Cinco ciclos de mutagénesis secuencial mediante PCR propensa a error, con selección sobre la base de la actividad catalítica y termoestabilidad, produjeron una enzima activa con una temperatura de fusión que se incrementó en 14ºC por encima de la del tipo salvaje. Se ha utilizado un enfoque similar con la subtilisina BPN ', una proteasa alcalina de la bacteria mesófila Bacillus amyloliquifacieus. Se obtuvo una enzima mutante que tiene actividad mejorada a baja temperatura pero sin pérdida de estabilidad a temperaturas más altas. Aunque las tasas mutagénicas en la PCR propensa a errores pueden controlarse por las condiciones utilizadas, el método tiene sesgo significativo y no todas las sustituciones de aminoácidos son accesibles mediante este enfoque.

Arreglar el ADN

La recombinación aleatoria de fragmentos de secuencias de genes estrechamente relacionados (DNA shuffling) crea genes novedosos y proporciona una base alternativa para la evolución enzimática dirigida. Esta técnica se ha aplicado a mutantes producidos por la PCR propensa a error para producir enzimas con actividad mejorada hacia sustratos no naturales. Como alternativa, se ha llevado a cabo el mezclado de ADN entre los genes homólogos naturales que proporcionan "diversidad funcional". En este caso, se produjo una biblioteca de proteínas quiméricas que comprendían segmentos de la enzima cefalosporinasa procedentes de diferentes especies y se ensayaron para mejorar la actividad de la monolactamasa. Este proceso fue mucho más eficiente que la barajadura de fragmentos de ADN de genes derivados por mutagénesis de una única secuencia. Claramente, el enfoque de barajado de ADN también podría aplicarse para generar variantes de las enzimas con una estabilidad o actividad mejorada hacia un sustrato particular. El barrido del ADN también se ha utilizado para la evolución funcional del operón de resistencia al arsénico (ars) de Escherichia coli, dando como resultado un aumento de 40 veces en la resistencia a la presencia de arseniato en el medio de crecimiento. Se encontró que el mutante resistente tenía 13 mutaciones en el operón ars y diez en la bomba de membrana de arsenito, mientras que otros mutantes dieron como resultado niveles aumentados de expresión del gen de la arseniato reductasa. Estos resultados demuestran que el mezclado de ADN puede mejorar la función de las vías de biocatálisis y biotransformación como resultado de efectos complejos e inesperados y son de considerable importancia para el desarrollo de procesos de biotransformación in vivo.

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