Un modelo de sitio de fosforilación Regulado

Un modelo de sitio de fosforilación Regulado-mTOR en Elongación Factor 2 quinasa modula la actividad de la quinasa y su unión a calmodulina

RESUMEN

la traducción del ARNm es un punto de control clave para la expresión génica y está regulada por diversos estímulos fisiológicos. Por ejemplo, se activa por la insulina, y esta activación consiste en la estimulación de una variedad de componentes de la maquinaria de traducción, varios de los cuales son regulados a través de señalización que implica el objetivo mamífero de la rapamicina, mTOR (21). mTOR es una proteína multidominio grande cuya función se inhibe específicamente por la rapamicina fármaco inmunosupresor. Componentes de traducciones ligadas a mTOR incluyen el represor de la traducción 4E-BP1 (proteína de unión 4E-factor de iniciación eucariótico 1) (21) y la proteína ribosomal (rp) S6 quinasas (S6Ks) (4). la señalización de mTOR también puede regular el ciclo celular, la autofagia, y otros procesos (20, 39). El ya alto nivel de interés en la señalización de mTOR se ha aumentado aún más por datos recientes que muestran que desempeña papeles importantes en el control de células y tamaño organismo (20, 44) y en la transformación celular (3, 31), así como en ciertas tumores benignos (30). Recientemente se han producido importantes avances en la comprensión de cómo las hormonas como la insulina estimula la señalización de mTOR. La insulina estimula la proteína quinasa B (PKB) a través de phosphatidylinositide (PI) 3-quinasa, y PKB fosforila el producto de la esclerosis tuberosa gen TSC2 complejo, también denominado tuberina. TSC2 forma un heterodímero con TSC1 que reprime la actividad mTOR aparentemente actuando como la proteína GTPasa-activador para la pequeña proteína G Rheb (para revisiones, véanse las referencias 28 y 30). La fosforilación de TSC2 por PKB alivia este asiento inhibitorio sobre la señalización de mTOR, que resulta en su activación. Sin embargo, los mecanismos que enlazan mTOR con el control de estos procesos permanecen oscuras. Existe, pues, una necesidad apremiante para aprender más sobre la señalización de mTOR, especialmente cómo se regula sus efectores.

Además de los S6Ks y 4E-BP1, ambos de los cuales modulan la iniciación de la traducción, la señalización de mTOR también regula el proceso de elongación de traducción a través de la fosforilación del factor de elongación 2 eucariota (eEF2) (40). eEF2 es una proteína de unión a GTP que media la etapa de translocación de alargamiento (10). Cuando está fosforilada en Thr56, eEF2 pierde su capacidad para unirse a los ribosomas y por lo tanto se inactiva (12). La insulina y otros estímulos inducen la desfosforilación de eEF2, y este efecto es bloqueado por la rapamicina (19, 40, 47, 48, 50). Donde estudiado, esto parece implicar una disminución en la actividad de la quinasa que actúa sobre eEF2, una enzima altamente específico llamado eEF2 quinasa (40, 48, 48,50). La capacidad de la insulina para disminuir la actividad quinasa eEF2 también es bloqueado por rapamicina, lo que implica que este efecto también está mediada a través de mTOR.

eEF2 quinasa es una enzima altamente inusual. La secuencia de su dominio catalítico difiere sustancialmente de la de otras proteínas quinasas, y no es un miembro, por ejemplo, de la superfamilia de quinasa Ser-Thr-Tyr principal(41). El medio C-terminal del polipéptido quinasa eEF2 contiene varios sitios de fosforilación y, en el extremo C-terminal, el sitio de unión para el sustrato eEF2 (16, 34). La actividad de la quinasa eEF2 normalmente es completamente dependiente de iones Ca2 + y calmodulina (CaM). El sitio de unión CaM-ha sido identificado como tumbado en el extremo N-terminal del polipéptido, adyacente al dominio catalítico, en una región que contiene residuos hidrófobos e básicos, tal como se encuentra para los sitios de unión a CaM-en otras proteínas(16, 34). Se identificaron previamente Ser366, que se encuentra en el extremo C terminal del dominio catalítico, como ser fosforilado por S6K y por p90 RSK, que se encuentra aguas abajo de la vía de la proteína quinasa activada por mitógeno clásica (50). La fosforilación de eEF2 quinasa en Ser359, que se identificó por primera vez como un substrato para el estrés proteína quinasa activada por 4, se divulga para ser regulados de una manera-rapamicina sensibles en respuesta al factor de crecimiento tipo insulina 1 (IGF1) (26).

Aquí identificamos un nuevo sitio de fosforilación en eEF2 quinasa regulada marcadamente en respuesta a la insulina de manera mTOR-dependiente. Este sitio (Ser78) no es fosforilada por cualquier conocido quinasa de proteínas en la vía mTOR. eEF2 quinasa es por lo tanto un objetivo de la señalización de mTOR independientemente de otros objetivos conocidos de esta vía, lo que implica la existencia de una novela (probablemente mTOR-controlado) proteína quinasa que actúa sobre Ser78 en eEF2 quinasa. Ser78 se encuentra inmediatamente adyacente al sitio de unión a CaM-quinasa en eEF2. Se demuestra que la insulina disminuye la unión de eEF2 a CaM in vivo y que este efecto es bloqueado por la rapamicina. Los efectos antagónicos de la insulina y la rapamicina en la leva de unión se suprimieron mediante la mutación de Ser78 a un residuo nonphosphorylatable, Ala. Estos datos proporcionan una explicación molecular para el mecanismo por el cual la insulina y mTOR controlar la actividad de eEF2 quinasa y de ese modo regular péptido cadena de elongación.

MATERIALES Y METODOS

Materiales.

[γ- 32P] ATP y materiales para la purificación de proteínas se obtuvieron de AmershamPharmaciaBiotech, Reino Unido. ATP no marcado era de Roche Molecular bioquímicos (Lewes, Reino Unido); medios de cultivo celular y IGF1 humano se obtuvieron de Gibco (Paisley, Reino Unido); microcistina-LR, wortmannin, rapamicina, PD98059 y U0126 eran de Calbiochem (Nottingham, Reino Unido); y las membranas Immobilon P eran de Millipore (Bedford, Reino Unido). Otros productos químicos eran de la mayor pureza disponible y se adquirieron de Merck (Poole, Reino Unido) o Sigma-Aldrich (Poole, Reino Unido). CaM se purificó a partir de cerebro bovino. [γ- 32 P] ATP y aumento de quimioluminiscencia reactivos se adquirieron de AmershamPharmaciaBiotech; wortmanina y rapamicina eran de Calbiochem. Albúmina de suero bovino (libre de ácido graso) era de Roche Molecular Biochemicals. La cicloheximida (CHX) fue de Sigma. A menos que se indique lo contrario, todos los demás reactivos se obtuvieron de Sigma o Merck.

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