Vectores de clonación en bacterias

INTRODUCCIÓN

Vectores de clonación en bacterias

Clonación

Un clon es un conjunto de células genéticamente idénticas, que proceden de un mismo progenitor por división celular.

El proceso de clonación de genes implica la construcción de moléculas de ADN recombinante, en estas moléculas se incluye el gen, o fragmento de ADN, a clonar. La molécula de ADN recombinante es posteriormente introducida en células hospedadoras, para que se replique usando las enzimas de la célula, de modo que todas las células descendientes poseerán, al menos, una copia de la molécula recombinante. La obtención de las moléculas de ADN recombinante es un proceso que se realiza in vitro, pero la replicación en el interior de la célula hospedadora es un proceso totalmente in vivo.

Las células hospedadoras son normalmente células bacterianas, aunque ocasionalmente también puede transferirse el ADN recombinante a células eucariotas, esto ocurre, sobre todo, cuando se quiere estudiar la expresión de genes eucariotas. La bacteria E. coli es la más usada para este fin. Se trabaja siempre con cepas modificadas genéticamente, a las que se les ha eliminado el sistema de restricción-modificación, para, de este modo, invalidar los sistemas que tiene la bacteria para evitar la intromisión de ADN extraño.

Una molécula de ADN recombinante se compone de:

 ADN exógeno (o pasajero): es el gen, o fragmento de ADN, que se quiere clonar. Éste puede tener distintos orígenes:

– Puede proceder de un genoma fragmentado.

– Puede ser un fragmento específico de ADN, amplificado mediante PCR.

– Puede ser ADNc (copia) procedente de ARNm.

– O puede ser ADN simplexo, que deberá pasarse a duplexo para clonarlo.

 ADN vector: molécula que porta el fragmento de ADN exógeno. Se clasifican en:

– Vectores de clonación: aquellos que permiten mantener el ADN exógeno en la célula hospedadora.

– Vectores de expresión: permiten transcribir y traducir la información genética dentro de la célula hospedadora.

Tipos: plasmidos, cosmidos, YACs, BACs, etc…

Cromosomas artificiales

Estos vectores se desarrollaron con el objetivo de clonar grandes segmentos de cromosomas eucarióticos. En la preparación de mapas físicos de genomas se utilizan vectores como los cósmidos, los YAC (cromosomas artificiales de levaduras), los BAC (cromosomas artificiales de bacterias) y los PAC (cromosomas artificiales basados en el fago P1).

Los YAC son minicromosomas de levadura creados por ingeniería genética que pueden contener insertos de ADN de 200 a 500 kb y contienen un origen de replicación y un centrómero de levadura, dos telómeros en los extremos del cromosoma, un marcador seleccionable y un sitio múltiple de clonación.

Los BAC se basan en el plásmido F de 7kb de E. coli y pueden llevar insertos de 300 kb, aunque el promedio es de 100 kb. Los PAC son equivalentes. Aunque los BAC y los PAC aceptan fragmentos menores que los YAC tienen algunas ventajas:

1. Son menos complejos y por lo tanto más fáciles de construir. Pueden amplificarse en bacterias y manipularse con la tecnología básica de los plásmidos bacterianos.

2. Contienen menor cantidad de insertos híbridos (insertos compuestos por dos o más fragmentos no contiguos en el genoma) que los YAC. Estos insertos híbridos pueden entorpecer los intentos de ordenar los clones

Por estos motivos los BAC han reemplazado a los YAC como vectores en la construcción de mapas físicos de cromosomas enteros.

Estos vectores simplifican mucho el proceso de secuenciación, ya que aún organismos simples como el nematodo Caenorhabditis elegans poseen enormes cantidades de ADN (100 Mb). En este caso se necesitarían 2.500 cósmidos para contener el genoma completo (el inserto promedio de un cósmido es de 40 kb). Los YAC pueden aceptar 1Mb, por lo cual el proceso se simplifica.

Cromosomas artificiales bacterianos

Para cartografiar y analizar genomas eucarióticos complejos, se ha desarrollado un vector multiuso denominado cromosoma artificial bacteriano (BAC) basado en el factor F de bacterias. El factor F es un plásmido que se replica independientemente y que está implicado en la transferencia de información genética durante la conjugación bacteriana. Puesto que los factores F pueden transportar fragmentos del cromosoma bacteriano de hasta 1Mb, han sido diseñados para que funcionen como vectores de DNA eucariótico. Los vectores BAC tienen los genes de replicación y de número de copias del factor F, e incorporan un marcador de resistencia a un antibiótico y sitios de restricción para insertar el DNA exógeno que se desee donar. Además, el sitio de donación está flanqueado por regiones promotoras que pueden utilizarse para generar moléculas de RNA y expresar así el gen donado, o para utilizadas como sonda para paseo cromosómico, y para secuenciar el DNA del inserto clonado.

Cromosoma artificial bacteriano (BAC). El sitio de clonación múltiple tiene diversos sitios de restricción únicos para la inserción de DNA exógeno. Las flechas marcadas como T7 y Sp6 son regiones promotoras que permiten la expresión de los genes clonados entre estas regiones

Aunque la levadura es un organismo eucariótico, puede manipularse y crecer de manera parecida a las células bacterianas. Además, la genética de las levaduras se ha investigado exhaustivamente, lo que ha proporcionado un gran catálogo de mutaciones y unos mapas genéticos altamente detallados de sus cromosomas. En levadura hay un plásmido de origen natural, denominado “plásmido 2 micras” (o “plásmido 2μ”), que se ha utilizado para construir varios vectores de clonación para levadura. Combinando secuencias de plásmidos bacterianos con secuencias del plásmido 2 micras, se pueden producir vectores con muchas propiedades útiles.

• Cromosomas artificiales de levadura.

Un segundo tipo de vector de levadura es el cromosoma artificial de levadura (YAC, del inglés “yeast artificial chromosome”). De tipo lineal, un YAC contiene telómeros de levadura en cada extremo, un origen de replicación (denominado secuencia de replicación autónoma o ARS), y un centrómero de levadura que permite la distribución del YAC replicado a las células hija durante la división celular. El YAC también contiene un marcador de selección en cada brazo (TRP1 y URA3), y un grupo de sitios de restricción únicos para insertar DNA.

Clonación

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