En esta tercer practica hicimos pruebas bioquímicas en cultivos de bacterias seleccionados de resiembra hecha en la segunda práctica.

Introducción

En esta tercer practica hicimos pruebas bioquímicas en cultivos de bacterias seleccionados de resiembra hecha en la segunda práctica. Los cultivos utilizados no fueron puros.

Para la identificación de la especie de bacteria se requiere de estas pruebas bioquímicas mediante métodos que se basan en la determinación de las características fenotípicas adicionales que reflejan el genotipo y, por lo tanto, la identidad única de los microorganismos que se analizaran. Existen una gran cantidad de pruebas y numerosos esquemas disponibles para la identificación final de las especies de Enterobacteriaceae. Las pruebas que generalmente se utilizan para identificar las características metabólicas de las enterobacterias son:

-Utilización de carbohidratos: se determina el tipo de azucares que pueden fermentar las bacterias, normalmente se utiliza el agar hierro triple azúcar (TSI) o medio Kliger.

-Producción de catalasa: se detecta si la bacteria presenta la enzima catalasa, se requiere de peróxido de sodio.

-Producción de indol: sirve para comprobar la presencia de la enzima triptofanasa, se utiliza el reactivo de Kovac o el de Ehrlich.

-Rojo de metilo: identifica las especies bacterianas que producen ácidos fuertes a partir de glucosa, se requiere del medio Voges-Proskauer/Rojo de metilo (VP-RM).

-Prueba de Voges-Proskauer: mide la conversión del acetil-metil-carbonil o acetoína en diacetilo, se necesita el medio VP.

-Utilización de citrato: detecta la capacidad de un microorganismo para utilizar citrato de sodio como única fuente de carbono, se requiere el medio citrato de Simmons.

-Producción de ureasa: determina si la bacteria produce la enzima ureasa, se utiliza el caldo urea.

-Producción de ácido sulfhídrico: se identifica si la bacteria es capaz de liberar azufre en forma de aminoácidos que contienen azufre, esto se puede observar en el medio SIM o TSI.

-Movilidad: se determina si la bacteria presenta flagelos, se puede utilizar el medio SIM o MIO.

-Actividad de o-nitrofenil-B-D-galactopiranosido: con esta prueba se detecta la presencia de la enzima B-galactosidasa, se conoce como prueba ONPG.

-Descarboxilación de lisina, ornitina y arginina: se utiliza para determinar si las bacterias contienen enzimas para descarboxilar aminoácidos específicos, esto se observa con el caldo descarboxilasa de Moeller.

-Producción de fenilalanina desaminasa: se detecta la presencia de enzima responsable de la desaminación oxidativa de la fenilalanina, se utiliza el agar urea de Christensen.

-Reducción de nitratos: se comprueba si la bacteria puede reducir los nitratos en nitritos, se requiere el caldo nitrato o agar nitrato.

El objetivo de esta tercera sesión es que aprendamos a interpretar las pruebas bioquímica y finalmente identifique las enterobacterias aisladas.

Material:

-1 Gradilla

-1 Mechero

-1 Matraz con solución salina isotónica estéril (SSI)

-2 Juegos para tinción de Gram: cristal violeta, lugol, alcohol-acetona, safranina.

-1 Puente para tinción

-1 Frasco de gotero con aceite de inmersión

-4 Tiras de papel filtro estériles

-1 Frasco gotero con agua oxigenada al 3%

1 Frasco gotero ámbar con reactivo para la prueba oxidasa

-3 Tubos 13x100mm con medio agar Hierro Triple Azúcar (TSI) (medio inclinado, color anaranjado)

-3 Tubos 13x100mm con Caldo Urea (color rosa)

-3 Tubos de 13x100mm con medio inclinado de agar Citrato de Simmons (color verde)

-3 Tubos de 13x100mm con caldo semisólido de SIM (color ámbar)

-6 Tubos de 13x100 con cado VP-RM (Voges Proskauer-Rojo de Metilo, color ámbar)

-Portaobjetos

-2 Asas bacteriológicas

-Encendedor

-Toallas de papel secante

-Microscopio

Procedimiento

1. Pruebas de identificación bioquímica de los cultivos puros seleccionados

1. Prueba de catalasa

Pasos:

-Antes de comenzar a trabajar lavamos con agua y jabón, y desinfectamos la mesa para el trabajo microbiológico.

-Lavamos los portaobjetos con agua y jabón, y para desengrasarlos, colocamos gotas de alcohol-acetona y frotamos la superficie inmediatamente con una toalla de papel secante.

-Para realizar la prueba colocamos sobre el portaobjeto con el asa bacteriológica una porción del cultivo de la colonia de bacterias rojas del medio MacConkey, y posteriormente agregamos una gotita de agua oxigenada sobre la muestra. Las bacterias que son catalasa positiva liberan oxigeno del agua oxigenada, cuya presencia se manifestó por la liberación de pequeñas burbujas. Las bacterias catalasa negativas no producen burbujas al adicionar el agua oxigenada.

-Aplicamos los mismos pasos para la colonia de bacterias blancas.

2- Prueba oxidasa

Las bacterias oxidasa positivas producen un color negro o azul intenso en 10 segundos. LA reacción se considera retardada si ocurre ente los 10 y 60 segundos posteriores. Si se observa desarrollo de color posterior a los 60 segundos la prueba se considera negativa.

Pasos:

-Con el asa bacteriológica colectamos una porción del cultivo de la colonia de bacterias rojas y lo extendimos sobre un papel filtro estéril, sobre éste adicionamos dos gotas del reactivo para la prueba de oxidasa.

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