PRACTICA DE PRUEBAS BIOQUIMICAS

PRÁCTICA #9 PRUEBAS BIOQUÍMICAS

OBJETIVOS

• Sembrar, leer e interpretar algunas pruebas bioquímicas útiles en la identificación de bacterias bacilares Gram negativas.

• Identificar el género y especie de la cepa problema.

INTRODUCCIÓN

Las pruebas bioquímicas se basan en la determinación de la presencia o ausencia de diferentes enzimas codificadas por el material genético del cromosoma bacteriano. Estas enzimas (catalasa, coagulasas, descarboxilasas, deaminasas, ureasas, peroxidasas, etc.) involucradas en el metabolismos bacteriano pueden ser evidenciadas en medios de cultivos especiales que contienen los substratos (hidratos de carbono, aminoácidos, etc.) sobre los cuales ellas actúa, junto con un sistema indicador que va a poner de manifiesto la degradación del substrato o la presencia de un metabolito especifico (ácido fórmico, ácido láctico, ácido succínico, indol, etc).

Las pruebas bioquímicas también evalúan la capacidad de reducir ciertos iones (ferroso a férrico), la presencia o ausencia de flagelos (prueba movilidad), la producción o no de hemolisinas, el requerimiento de algunos factores especiales (proteínas), la producción de algunas toxinas con capacidad virulenta (toxina diftérica, toxina botulínica, etc).

MATERIAL

Cepas bacterianas

Agar TSI (triple azúcar hierro)

Agar LIA (lisina hierro agar)

Agar UREA

Agar CITRATO DE SIMMONS

Caldo MR-VP

Agar MIO

PROCEDIMIENTO

Siembra:

Sembrar la cepa problema en toda la bacteria disponible de acuerdo a la siguiente instrucción.

1. AGAR TSI

Siembra: Estría en superficie y la picadura central hasta el fondo del tubo.

Fundamento: En TSI se determina la capacidad de un microorganismo para utilizar los hidratos de carbono GLUCOSA, LACTOSA y/o SACAROSA, con producción o no de gases (CO2, H2) junto con la producción de ácido sulfhídrico (H2S)

Interpretación: La lectura se efectúa después de 18 a 24 horas de incubación a 37°C. Se lee una fracción, la reacción ocurrida en la profundidad del medio corresponde al numerador (parte aerobia) y la reacción ocurrida en la profundidad del medio corresponde al denominador (parte anaerobia). La acidez se denomina con la letra A (color amarillo) y la alcalinidad con la letra K (color rojo).

En este medio se leen las siguientes reacciones bioquímicas:

• Fermentación de la glucosa (K/A)

• Fermentación de la glucosa, lactosa y/o sacarosa (A/A)

• No fermentación de los carbohidratos (K/K)

La bacteria no utiliza los hidratos de carbono, produciendo aminas que alcalinizan el fondo y la superficie del medio.

Algunas bacterias no fermentadoras solamente atacan la peptona anaeróbicamente dando un TSI: K/N, es decir no hay cambio en el fondo del tubo

• Producción de gas: ruptura del medio

• Producción de H2S: ennegrecimiento del medio

El agar TSI contiene tres azucares: glucosa (1g/L), lactosa (10g/L), sacarosa (10g/L).

Como indicador del pH tiene Rojo de Fenol el cual vira en color amarillo en presencia de acidez y al color rojo en presencia de alcalinidad.

Tiene como fuente de azufre TIOSULFATO DE SODIO, necesario para que las bacterias puedan producir H2S y como indicador de H2S SULFATO FERROSO el cual reacciona con el H2S produciendo un precitado negro e insoluble de sulfato ferroso.

2. AGAR LIA

Siembra: Doble picadura hasta el fondo del tubo y siembra en superficie

Fundamento: En agar LIA se determina la capacidad de un microorganismo para utilizar el aminoácido Lisina desacarboxilandolo o desaminándolo, la fermentación de glucosa, la producción o no de gases (CO2), junto con la producción o no de ácido sulfhídrico (H2S). Se efectúa después de 18 a 24 horas de incubación (48 horas si es necesario) a 37°C. Se lee la acidez misma que se denomina con la letra A (color amarillo) y la alcalinidad con la letra K (color púrpura). El indicador del pH del medio es PÚRPURA DE BROMOCRESOL, el cual en acidez vira al color amarillo y en alcalinidad al color púrpura. Por contener pequeña cantidad de glucosa (1g/L) al ser fermentada al fondo del tubo es amarillo y la superficie alcalina.

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