Pruebas Bioquimicas

PRUEBAS BIOQUIMICAS

Las pruebas bioquímicas consisten en distintos test químicos aplicados a medios biológicos, los cuales, conocida su reacción, nos permiten identificar distintos microorganismos presentes.

Su sistema de funcionamiento generalmente consiste en determinar la actividad de una via metabólica a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer incorpora o no.

Para realizar las pruebas bioquímicas se dispone de multiples medios, los cuales se deben aplicar de acuerdo a las exigencias del microorganismo en estudio.

De la amplia variedad de pruebas bioquímicas, nosotros en laboratorio utilizaremos 10, aplicados a 5 especies de microorganismos.

Además estudiaremos los resultados que estos test arrojan, comparando resultados experimentales entre los distintos grupos de trabajo de nuestro laboratorio.

• Prueba de la Oxidasa

El objetivo de la prueba “Oxidasa” es buscar la presencia de la enzima Citocromo C oxidasa.

Se trata de un enzima que oxida el citocromo C de la cadena transportadora de e-. Este se detecta utilizando el tetra para fenilendiamina: el reactivo de oxidasa contiene este compuesto que va a ser oxidado por la citocromo C oxidasa. En estado reducido es incolora, pero cuando se oxida vira a púrpura.

Procedimiento:

Con un pequeño papel de filtro añadimos reactivo de Kovacs, lo impregnamos y a partir del tubo con la bacteria problema tomamos un poco con el asa de platino y ponemos en el papel. Tras unos 30 segundos, observamos si ha ocurrido algún cambio.

Las bacterias que dan positivo a esta prueba tienen generalmente un ciclo respiratorio oxidativo.

Se considera positva esta prueba cuando toma un color púrpura la muestra.

Resultados:

(+) Pseudomonas aeruginosa

( - ) Escherichia coli

• Prueba de la Catalasa

El Objetivo es buscar la presencia de la enzima catalasa

El peróxido de hidrógeno se produce al utilizar la bacteria el azúcar por vía oxidativa. Al ser éste un compuesto muy oxidante las bacterias la eliminan mediante la producción de la enzima catalasa (H2O2 -> H2O + ½ O2).

Prodecimiento:

Agregamos aproximadamente 5 ml. de peróxido de hidrógeno al 3% a un tubo de ensayo previamente esterilizado a continuacion tomamos una muestra de la cepa del microorganismo a estudiar y la introducimos por el tubo de ensayo, la muestra solamente debe acercrse a la muestra de la solucion liíquida de peróxido de hidrogeno y debemos observar la reacción de esta.

La prueba se considera como positiva si observamos burbujas de oxígeno.

Resultados:

(+) Staphylococcus aureus

( - ) Streptococcus spp.

• Prueba de la Coagulasa

La coagulasa es un enzima capaz de desnaturalizar la bibrina del plasma. El objetivo es buscar en factor de aglutinación de los microorganismos cuando estos se mezclan con el plasma. Esta prueba se utiliza para diferenciar microorganismos del generoStaphylococcus.

Procedimiento:

Preparamos una mezcla de 0,1 ml. de CCC (caldo cerebro corazon) y 0,3 ml. de plasma de conejo en un tubo de ensayo previamente esterilizado. La muestra ya contiene cepas de St. Aureus. Tapamos el tubo de ensayo con algodón hidrofílico y lo llevamos a baño María a 37° C durante una hora, observando la muestra cada 15 minutos. Al completa la hora, sacamos las muestras y observamos sus resultados.

Resultados:

Estratificaremos los resultados en 4 distintos niveles:

1: pequeños coágulos no oganizados

2: pequeños coágulos oganizados

3: gran coágulo organizado

4: todo el contenido aparece coagulado y se mantiene cuando invierte el tubo.

Se consideran positivos los niveles 3 y 4.

(+) Staphylococcus aureus

( - ) Staphylococcus epidermis.

• Prueba MIO (Motility-Indole-Ornitine ó Motilidad-Indol-Ornitina)

Esta prueba bioquímica permite identificar bacterias de acuerdo a su motilidad a la reacción de Indol a la descarboxilación de la ornitina.

Procedimiento:

Inocular en picada las cepas de micro organimos en el medio de cultivo e incubar por 24 horas a 37° .

Interpretación y Resultados:

Reacción Interpretación

Enturbiamiento del

Agar. Hay movilidad

Agar transparente de-

sarrollo solo en picada No hay movilidad

Azul (alcalino) Descarboxila ornitina

Coloración Amarilla (ácido) No descarboxila

Rojo (anillos) Indol (+)

Amarillo (anillos) Indol ( - )

• Prueba TSI (Triple Sugar Iron ó Triple Azúcar Hierro)

El TSI es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la capacidad de producción de ácido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un único medio. Tambien permite la identificación de la producción de SH2.

Esta es una prueba específica para la identificación a nivel de género en la familia Enterobacteriaceae, con objetivo de diferenciar entre:

• bacterias fermentadoras de la glucosa

• bacterias fermentadoras de la lactosa

• bacterias fermentadoras de sacarosa

• bacterias aerogénicas

• bacterias productoras de SH2 a partir de sustancias orgánicas que contengan azufre.

Prodedimiento:

Inocular los tubos de TSI con punta (alambre recto). Para eso introducir la punta hasta 3 a 5 mm. del fondo del tubo. Tras retirar el alambre del fondo, estriar el pico con un movimiento hacia uno y otro lado. Incubar a 35° durante 24 horas. Posteriormente se debe medir el pH de los cultivos.

Resultados:

• Pico alcalino/fondo alcalino : no hay fermentación de azucares. Característica de bactrias no fermentadoras como Pseudomonas sp.

• Pico alcalino/fondo ácido : Glucosa fermentada,lactosa ni sacarosa fermentadas. Shigella spp.

• Pico alcalino/fondo negro : Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas, producción de ácido sulfhídrico. Salmonela spp.

• Pico ácido/fondo ácido: Glucosa y lactosa y/o sacarosa fermentadas. Puede producirse SH2 o no. Escherichia coli.

A estos resultados se les agrega el resultado de la producción de gas.

• Prueba LIA (Lysine Iron Agar ó Agar Lisina Hierro)

Esta prueba permite diferenciar los microorganimos que producen descarboxilación o desaminación de la lisina. Se pude detectar ademas la produccion de SH2 y es más sensible que el TSI para la detección de SH2. Es muy utilizado par descartar Salmonella de aislamientos primaros.

Procedimiento:

Inocular en forma de estría las cepas de micro organimos en el medio de cultivo e incubar por

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