Pruebas Bioquimicas

PRUEBAS BIOQUIMICAS

CATALASA

Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra el la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo. La principal excepción es Streptococcus.

El fundamento se basa en que la Enzima Catalasa que tiene la Bacteria desdobla el Peróxido de Hidrógeno en Agua y Oxígeno.

Originariamente, esta prueba era utilizada para diferenciar entre los siguientes géneros:

Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+).

Bacillus (+) de Clostridium (-).

Lysteria monocytogenes (+) y/o Corynebacterium (+, con las excepciones de C.pyogenes y C.haemolyticum, ambos -) de Erysipelothrix (-).

Una prueba de rutina de la catalasa a temperatura ambiente puede hacerse siguiendo tres técnicas:

Método del portaobjetos (recomendado):

Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24 horas y colocar sobre un portaobjetos limpio de vidrio.

Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H2O2 al 30% sobre el microorganismo sin mezclarlo con el cultivo.

Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo).

Desechar el portaobjetos en un recipiente con desinfectante.

Si se invierte el orden del método (extender la colonia sobre el agua oxigenada) pueden producirse falsos positivos.

Método del tubo de ensayo:

Agregar 1ml de H2O2 al 30% directamente a un cultivo puro de agar en slant densamente inoculado.

Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo).

Precauciones: Si se utilizan para esta prueba cultivos procedentes de agar sangre, se debe tener la precaución de no retirar algo de agar con el asa al momento de desprender la colonia ya que los eritrocitos del medio contienen catalasa y su presencia dará un falso resultado positivo.

Método de la caja de Petri:

Agregar una gota de Peróxido de hidrógeno al 30% con un gotero única y directamente sobre la colonia presuntiva en la caja de Petri.

Una efervescencia (burbujeo) producida por la bacteria se tomará como positivo.

CITRATO

Esta prueba sirve para determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono y compuestos amoniacales como única fuente de nitrógeno en su metabolismo, provocando una alcalinización del medio. Entre las enterobacterias estas características se dan en los géneros: Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Citrobacter y algunas especies de Salmonella. Sin embargo, Escherichia, Shigella, Salmonella typhi y Salmonella paratyphi son incapaces de crecer con esos nutrientes.

Se cultiva el microorganismo en agar citrato de Simmons. Este medio contiene citrato de sodio y fosfato de amonio como fuentes de carbono y de nitrógeno respectivamente y azul de bromotimol como indicador de pH. Sólo las bacterias capaces de metabolizar el citrato podrán multiplicarse en este medio y liberarán iones amonio lo que, junto con la eliminación del citrato (ácido), generará una fuerte basificación del medio que será aparente por un cambio de color del indicador de pH, de verde a azul.

El fundamento de ésta prueba se basa en que la bacteria al alimentarse del citrato libera iones amonio y aumenta el valor de pH haciendo alcalino el medio.

FENILALANINA DESAMINASA

Esta prueba determina la capacidad de un organismo para desaminar el aminoácido fenilalanina en ácido fenilpirúvico por su actividad enzimática de fenilalanina desaminasa, con la consiguiente acidez resultante. Esta actividad enzimática es característica de todas las especies del género Proteus y del grupo Providencia por lo que se usa para separar ambos géneros de otras enterobacterias.

Se cultiva el microorganismo en agar fenilalanina sembrando la superficie del slant con abundante inóculo e incubando durante 12-16 horas. Seguidamente se añade 0,2ml de una solución de cloruro férrico al 10% de manera que inunde todo el crecimiento. La presencia de ácido fenilpirúvico (prueba positiva) se manifiesta por la aparición de un color característico verde oscuro o verde-azulado.

INDOL

Mediante esta prueba se detecta la liberación de indol en un cultivo bacteriano. El fundamento se basa en la degradación del aminoácido triptófano mediante la enzima triptofanasa.

Para la realización de esta prueba la bacteria se cultiva durante 24-48 horas en un caldo de triptona con NaCl al 0,5% (la triptona presenta abundante triptófano). Para la posterior detección del indol se usa el reactivo de Kovacs que se puede preparar con los siguientes ingredientes:

Alcohol amílico o isoamílico (puede sustituirse por alc.butílico)........150ml

p-dimetilamino-benzaldehído..........................................................10g

HCl (concentrado).........................................................................50ml

Se disuelve primero el aldehído en el alcohol y después se agrega lentamente a esta mezcla el ácido. Para el control de calidad del reactivo se pueden utilizar cultivos conocidos. Las más convenientes son Escherichia coli (indol+) y todas las especies de Klebsiella (indol-).

Si la bacteria posee la enzima triptofanasa, al añadir al medio 5 gotas del reactivo de Kovacs, se producirá un anillo de color rojo en la superficie del caldo y la prueba será considerada positiva. Si esto ocurre después de 24 horas, la prueba se considera completa, pero si es negativo deberá incubarse otras 24 horas y repetirse la prueba. Por ello es conveniente hacer siempre la prueba no en el tubo incubado sino en una porción de unos 2ml que se retira de él asépticamente.

LACTOSA

Esta prueba se usa para diferenciar entre las enterobacterias en general y el grupo de las coliformes. Se trata por tanto de una prueba de gran importancia debido a que los coliformes se utilizan como organismos indicadores de contaminación fecal en análisis, sobre todo, de aguas. En bacteriología se define el grupo de organismos coliformes como los "bacilos Gram negativos, aerobios y anaerobios facultativos, no formadores de esporas y que fermentan la lactosa con formación de gas a 35ºC en 48 horas". No se trata de un grupo taxonómico e incluye una gran variedad de bacterias, la mayoría de ellas de origen intestinal.

Una manera sencilla de realizar la prueba de la fermentación de la lactosa en enterobacterias es sembrar el microorganismo en agar McConkey, ya que este medio, además de selectivo frente a bacterias no entéricas, es diferencial ya que contiene lactosa y un indicador de pH (rojo neutro).

En agar McConkey las bacterias Gram positivas ven inhibido su crecimiento debido a la presencia de sales biliares y cristal violeta y sólo crecerán las enterobacterias,

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