Pruebas bioquímicas primarias

INTRODUCCIÓN.

Las pruebas bioquímicas primarias son usadas para determinar el género de la mayoria de las bacterias.

1. Tinción de GRAM.

2. Prueba de catalasa.

3. Prueba de oxidasa.

4. Prueba de oxidación/fermentación conocida como OF.

5. Motilidad.

Tinción de GRAM.

Fue creada en 1884 por el médico danes Hans Christian Gram, Esta tinción nos permite separar a la mayoría de las bacterias en dos grupos las gram positivas que se tiñen de color violeta y las gram negativas que se tiñe de color rosa. La diferencia en la tinción radica en las estructuras de la pared celular de las bacterias.

Reactivos usados en la tinción de Gram.

–Agua estéril para realizar el frotis.

–Cristal violeta también conocido como violeta de genciana.

–Safranina.

–Una mezcla de alcohol-acetona 1:1.

–Agua corriente

Prueba de la oxidasa.

Esta prueba esta basada en la identificación de una enzima bacteriana llamada citocromoC oxidasa y para reducir el nombre se le dice oxidasa.

Todas las bacterias aerobias obtienen su energía en forma de ATP a partir del proceso de respiración también llamado cadena respiratoria, este se lleva a cabo en la membrana celular bacteriana, en las siguientes lineas se dara una breve explicación de la cadena respiratoria solo con la finalidad de entender de donde proviene y que realiza la enzima citocromoC oxidasa, entiendase que todo este proceso tiene la finalidad de producir ATP. En la respiración hay una secuencia de enzimas y transportadores que pasan los electrones desde sus sustratos hasta llegar al citocromoC, la enzima llamada citocromoC oxidasale quita electrones al citocromoC, estos electrones son transferidos por la enzima al oxígeno siendo este el último aceptor de electrones en la cadena respiratoria, finalmente debido a que el oxígeno tiene un exceso de electrones puede atraer átomos de Hidrógeno formando dos posibles productos: Agua o peróxido de hidrógeno.

Reactivos usados en la prueba de oxidasa.

Se utilizan colorantes cromógenos que actúan como aceptadores artificiales de electrones que sustituyen de cierta manera al oxigeno usado por la bacteria, los más usados son:

 Tetrametil-p-fenilendiamina.

 Dimetil-p-fenilendiamina.

 Indofenol.

El reactivo basado en una disolución acuosa de tetrametil-p-fenilendiamina al 1%, es el más común y recibe el nombre de reactivo de Kovacs. Este reactivo se puede impregnar en discos o fragmentos de papel filtro grueso. En el comercio ya se venden tiras o discos impregnados con el reactivo..

Factores a considrerar en la pueba de oxidasa.

 No considerar un resultado positivo después de 30seg ya que el oxigeno molecular del ambiente oxida al reactivo.

 No usar asa bacteriológica metálica ya que la mayoría de estas con tienen hierro y este es capaz de oxidar el reactivo dando nos falsos positivos.

 No realizar la prueba de bacterias que provienen de colonias obtenidas de medios de cultivos que contienen glucosa u otro carbohidrato ya que la fermentación del carbohidrato inhibe a la oxidasa dando como resultado falsos negativos en la prueba.

 Para realizar la prueba usar bacterias provenientes de medios de cultivo como son: Agar sangre, Agar BHI, agar tripticasa soya, agar nutritivo, agar Mueller Hinton.

Prueba de la catalasa.

El peróxido de hidrógeno es el producto final del metabolismo oxidativo de carbohidratos, a esta vía metabólica recibe el nombre de metabolismo aerobio-oxidativo.

La acumulación del peróxido es muy toxico por lo que la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas exceptuando a Streptococcus sp. producen una enzima llamada catalasa que degrada el peróxido de hidrógeno obteniendo agua y oxigeno gas.

Técnica e interpretación de la prueba.

El reactivo utilizado en la prueba es el peróxido de hidrogeno al 30%, Hay diferentes técnicas para realizar la prueba la mas común es poner una gota de peróxido en el portaobjetos y posteriormente con un palillo plano tomar un poco de bacteria a partir de una colonia aislada, si se observa el burbujeo generalmente intenso significa que hay producción de oxígeno por lo tanto se entiende que hay presencia de la enzima catalasa., hay bacterias que dan una reacción positiva debil aunque son las menos.

Prueba de oxidación y fermentación también conocida como OF.

Las bacterias ocupan diferentes vías metabólicas para obtener sus nutrientes y la energía, casi todas las bacterias consumen algún tipo de carbohidrato generalmente el mas utilizado por las bacterias es la glucosa, usan la vía oxídativa, fermentativa o ambas.

La vía oxidativa utiliza oxígeno, un sinónimo es vía aerobia. El metabolismo fermentativo no utiliza oxigeno, sinónimo metabolismo anaerobio.

Ph debe ser 7.1, que dara un color verde en la preparación.

Se van a usar dos tubos, utilizando un asa recta la cual se flamea en el mechero, se puede enfriar en agar estéril, después se toma un poco de bacteria a partir de una colonia aislada posteriormente se inoculan ambos tubos por el método de picadura y finalmente se preparan las condiciones de los tubos, un tubo se cerrara su tapa de tal forma que quede floja con la intención de que entre algo de oxigeno, al segundo tubo se le agregara 1.5-2ml de aceite mineral estéril y la tapa se cerrara completamente, se incubarán durante 24h.

Inoculación por picadura.

Prueba de motilidad.

La motilidad se puede observar por un crecimiento turbio lejos de la picadura realizada en la inoculación de los medios OF o en un medio SIM, este método es de confianza variable ya que la picadura se pudo haber hecho chueca o irregular lo que nos darian falso positivo. Para evitar este factor se realiza la técnica de gota suspendida bacteriana.

Técnica de gota suspendida: Agregar sobre un portaobjetos una gota de solución fisiológica salina estéril, ponerle un poco de muestra bacteriana, homogeneizar de tal forma que la gota no se extienda mucho, ponerle encima un cubreobjetos al que previamente se le a puesto una base de 4 bolitas pequeñas de plastilina con el objetivo de evitar que aplaste totalmente la gota con bacteria, finalmente observar al microscopio con un objetivo de 40X. Se alcanzan haber bacterias muy pequeñas y casi translúcidas moverse a velocidad variable, observar al menos de 5-10 bacterias recorrer todo el campo de visión para declarase una motilidad positiva. La mayoría de las bacterias motiles son de morfología bacilar o sea Bacilos., Pero no todos los bacilos

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