Pruebas Bioquimicas

PRUEBAS BIOQUÍMICAS

INDOL

Introducción

El indol es uno de los productos de degradación metabólica del aminoácido triptofano. Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano con producción de indol, ácido pirúvico y amoníaco. La producción de indol es una característica importante para la identificación de muchas especies de m.o.

Principio

La prueba de indol está basada en la formación de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehído del p-dimetilaminobenzaldehído. Este es el principio activo del reactivo de Kovacs descrito más adelante. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptofano.

Medios y reactivos

Caldo triptofano

Peptona o digerido pancreático de caseína 2g

Cloruro de sodio 0,5 g

Agua destilada 100 ml

Reactivo de Kovacs

Alcohol amílico o isoamílico 150 ml

p-dimetilaminobenzaldehído 10 g

HCl conc. 50 ml

Procedimiento

Inocular el caldo triptofano con el m.o. en estudio e incubar a 35°C durante 18 a 24 horas. Al finalizar este período, añadir 5 gotas de reactivo por la pared interior del tubo.

Interpretación

El desarrollo de un color rojo intenso en la interfase del reactivo y el caldo, segundos después de añadir el reactivo indica la presencia de indol y un resultado de la prueba positiva.

Controles

Escherichia coli: positivo

Klebsiella pneumoniae: negativo (mayoría de las cepas)

ROJO DE METILO - VOGES-PROSKAUER (RM VP)

Principio

Una de las características taxonómicas que se utilizan para identificar los diferentes géneros de enterobacterias lo constituyen el tipo y la proporción de productos de fermentación que se originan por la fermentación de la glucosa. Se conocen dos tipos generales: la fermentación ácido-mixta y la fermentación del 2,3 butanodiol. En la fermentación ácido mixta se forman fundamentalmente láctico, acético y succínico, además de etanol, H2 y CO2. En la vía del butanodiol se forman cantidades menores de ácido (acetato y succinato) y los principales productos son el butanodiol, etanol, H2 y CO2. El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo de viraje entre 6,0 (amarillo) y 4,4 (rojo), que se utiliza para visualizar la producción de ácidos por la vía de fermentación ácido mixta. El acetil-metil-carbinol (o acetoína) es un producto intermediario en la producción de butanodiol. En medio alcalino y en presencia de oxígeno la acetoína es oxidada a diacetilo. Este se revela en presencia de alfa-naftol dando un color rojo-fucsia

Medios y reactivos

Caldo RM/VP

Peptona 7g

Glucosa 5g

Fosfato dipotásico 5g

Agua destilada 1L

pH = 6,9 ± 0,1

Indicador de pH rojo de metilo

Rojo de metilo 0,1 g en 300 mL de etanol 95°

Agua destilada 200 ml

Revelador VP

alfa-naftol (solución al 5% en etanol 95°)

Solución de KOH al 40% en agua destilada

Procedimiento

Inocular el caldo RMVP con un cultivo puro de no más de 24 horas del m.o. en estudio. Incubar a 35°C durante 48 horas. Luego de finalizado el tiempo de incubación transferir 1 mL del caldo a un tubo limpio para VP. En el caldo restante revelar RM agregando unas 4 - 8 gotas del indicador rojo de metilo. Para revelar VP agregar 0,6 ml (10 gotas) de alfa-naftol al 5% y 1 gota de KOH al 40%. Agitar cuidadosamente para exponer el medio al oxígeno atmosférico y dejarlo reposar durante 10 a 15 minutos.

Interpretación

La prueba RM es positiva si se desarrolla un color rojo estable. Esto indica que la producción de ácido es suficiente para producir el viraje del indicador y el m.o. fermentó la glucosa por la vía de ácido mixta. Un color anaranjado, intermedio entre el rojo y el amarillo no es considerado como positivo.

La prueba VP es positiva si se desarrolla un color rojo-fucsia luego de 15 minutos, que indica la presencia de diacetilo, producto de oxidación de la acetoína.

Controles

RM positivo, VP negativo: Escherichia coli

RM negativo, VP positivo: Enterobacter aerogenes

UTILIZACIÓN DE CITRATO

Introducción

La utilización de citrato como única fuente de carbono es una prueba útil en la identificación de enterobacterias.

Principio

La utilización de citrato como única fuente de carbono se detecta en un medio de cultivo con citrato como única fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinización del medio. Este aumento de pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a pH 7,6.

Medios y reactivos

Medio de Simmons

Fosfato diácido de amonio 1g

Fosfato dipotásico 1g

Cloruro de sodio 5g

Citrato de sodio 2g

Sulfato de magnesio 0,2 g

Agar 15 g

Azul de bromotimol 0,08 g

Agua destilada c.s.p. 1L

pH = 6,9

Procedimiento

Se inocula la superficie del agar inclinado con una sola estría en el pico. Utilizar un cultivo de 24 horas en un medio sólido y cuidando no arrastrar medio de cultivo, ya que se pueden producir falsos positivos por crecimiento a partir del medio de cultivo del inoculó. Incubar a 35°C durante 4 días.

Interpretación

El ensayo es positivo cuando se observa crecimiento a lo largo de la estría, acompañado o no de un viraje del indicador al azul.

Controles

Positivo: Klebsiella spp.

Negativo: E.coli

DESCARBOXILACIÓN DE LISINA Y ORNITINA

Introducción

La descarboxilación de aminoácidos es llevada a cabo por descarboxilasas y se forman aminas y CO2. Cada descarboxilasa es específica para un aminoácido y la reacción es completa e irreversible. Los aminoácidos ensayados habitualmente para la identificación son lisina, ornitina y arginina.

Principio

El caldo descarboxilasa de Moeller es el medio base más comúnmente usado para la determinación de las descarboxilasas en enterobacterias. Se prepara un tubo con el medio conteniendo el aminoácido a ensayar y un tubo control con medio base sin aminoácido. Se cubren con una capa de aceite mineral (vaselina líquida) para hacer el medio anaerobio de manera que ocurra la fermentación de la glucosa que contiene. Durante las primeras etapas de la incubación en ambos tubos se observará viraje del

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