Electroforesis nativo

Protocolo n°20

ELECTROFORESIS NATIVO  - PAGE NATIVO

Protocolo para armar el gel:

1. Gel concentrador (arriba)                               Para 1 gel                        Para 2 geles

• Acrilamida – bisacrilamida (30: 0,8)                    0,3 ml                                0,6 ml
• Buffer Tris – HCl pH= 6,5 0,5M                             0,5 ml                                1 ml
• Agua bidestilada                                                     1,2 ml                                2,4 ml
• TEMED                                                                      2,4 µl                                 4,8 µl
• Persulfato de Amonio 10% (PSA)                         6,6 µl                                 13,2 µl

1. Gel separador/ de resolución (10%) ( abajo)      Para 1 gel                    Para 2 geles

• Acrilamida – bisacrilamida (30: 0,8)                        1,65ml                              3,30 ml
• Buffer Tris – HCl pH= 8,8 1,5M                                 1,25 ml                            2,50 ml
• Agua bidestilada                                                         2,10 ml                             4,20 ml
• TEMED                                                                          6 µl                                   12 µl

• Persulfato de Amonio 10% (PSA)                             20 µl                                 40 µl  

1. Buffer de corrida (para 1L)

• Glicina  14,4 g.
• Tris   3g.
• Agua bidestilada (1000 ml volumen final)

1. Buffer de siembra nativo:

• Buffer Tris-HCl pH= 6,8 0,5M
• Glicerol 20 %
• Azul de bromo fenol 0,05%

Armado del soporte:

Limpio los vidrios con alcohol

Coloco la goma de base

• Coloco el soporte verde con las patas hacia abajo.
• Coloco el vidrio grueso hacia atrás con el borde que sobresalen hacia adentro y la parte que se abre del borde hacia arriba.
• Coloco el vidrio finto delante del grueso.
• Cierro las orejas del soporte verde.
• Coloco el soporte verde con los vidrios sobre las gomas grises del soporte transparente y ajusto con la traba de arriba.
• Luego agrego agua hasta arriba y veo sin pierde agua
• Descarto el agua
• Lleno con el gel separador aproximadamente hasta la línea verde y dejo gelificar aproximadamente 15 min en estufa a 37ºC (a mayor temperatura gelifica mas rápido)
• Agrego 100 ul de agua encima del gel separador
• Llevo el frasco con el resto de gel separador como guía para saber cuando gelifico
• Lleno con el gel concentrador, coloco el peine y dejo gelificar de igual manera que el gel anterior.
• Saco los vidrios de los soportes y coloco sobre el soporte blanco con la parte mas alta hacia afuera. Coloco este soporte sobre el transparente y cierro las orejas.
• Coloco los soportes con los vidrios y geles en la cuba, y lleno con el Buffer de corrida Tris- Gly. Saco los peines.
• Siembro mezcla 10 µl de muestra y 5 µl de Buffer de siembra. Puedo guiarme con el marcador de calles amarillo.
• Corro a 100 V generalmente ( entre 65 V- 100 V) durante de 1h 50 min (hasta que el frente de corrida llegue a la línea verde)
• Revelo el gel por proteína o actividad.

Revelado por actividad lipasa – esterasa:

• En un frasquito coloco aproximadamente 2 ml de acetona.
• Agrego una pizca de α-naftilacetato (aprox 0,04g) y agito.
• Agrego el doble de Fast Blue.
• Coloco la mezcla en 50 ml de Buffer fosfato 100 mM y mezclo (solución de revelado)
• Coloco la solución de revelado sobre una bandeja que contenga el gel y dejo que aparezcan las bandas.
• Detengo y fijo con acetona 5%.

Revelado por Coomasie Blue:

• Coloco el gel en una bandeja y cubro con la solución de Coomasie Blue.
• Agitar 3 min.
• Tirar en frasco descartador el Coomasie.
• Decolorar el gel con mezcla de 50 % de metanol con 12 % de acido acético y 30% de etanol con 12 % de acido acético.

Revelado por Plata:

• Fijar el gel con mezcla de etanol 10% con acido acético 5%.
• Lavar con etanol 50% por 20 min con agitación.
• Lavar con etanol 30 % por 20 min con agitación.
• Agregar tiosulfato de sodio 0,2g/l durante 3 a 10 min.
• Lavar 2 veces con agua destilada.
• Agregar solución de Ag NO3 2 g/l con formaldehido 0,75 ml/l (37%) en oscuridad durante 15 a 30 min con agitación.
• Lavar 2 veces con agua destilada.
• Revelar con solución de Na2CO3 60 g/l con formaldehido 0,5 ml/l y tiosulfato de sodio 4mg/l
• Detener con mezcla de 50 % de metanol con 12 % de acido acético y 30% de etanol con 12 % de acido acético.

Secado del gel en celofán:

• coloco celofan mojado sobre un vidrio, estiro de modo que no queden burbujas de aire.
• Coloco el gel.
• Cubro con celofan mojado y estiro hasta que no tenga burbujas de aire.
• Doblo el celofan hacia atrás y dejo secar hasta el otro día.

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