Practica Electroforesis
Enviado por fernandooj • 21 de Mayo de 2012 • 1.222 Palabras (5 Páginas) • 1.337 Visitas
Introducción
La concentración e integridad del ADN extraído, así
como el tamaño de distintos fragmentos de ADN
(por ejemplo, productos de PCR) pueden ser
verificadas mediante electroforesis en geles de
agarosa o poliacrilamida. La electroforesis consiste
en la separación de moléculas (proteínas,
isoenzimas, ácidos nucleicos) a través de una matriz
tamponada (agarosa, acrilamida, almidón). La matriz
funciona como un filtro, separando las moléculas en
un campo eléctrico, de acuerdo al tamaño y la carga
neta que poseen. En el caso de los ácidos nucleicos, el grupo fosfato es el responsable por la fuerte
carga negativa en condiciones de pH neutro, haciendo que los fragmentos migren hacia el polo
positivo (ánodo) durante la electroforesis.
La resolución y velocidad de separación de fragmentos de ADN por electroforesis son reguladas a
través de la concentración de agarosa (o acrilamida) en el gel y el voltaje aplicado durante la
electroforesis. La agarosa funciona como un filtro en el que los fragmentos de menor tamaño
migran más rápidamente hacia el ánodo que aquellos de mayor tamaño. Al aumentar la
concentración de agarosa se dificulta el movimiento de los fragmentos a lo largo del gel,
permitiendo obtener una mayor resolución en los fragmentos de menor longitud. El incremento
del voltaje aumenta proporcionalmente la velocidad de migración de los fragmentos en el gel.
Los ácidos nucleídos separados en geles de agarosa pueden visualizarse mediante tinción con
colorantes fluorescentes, lo cual permite evaluar su integridad y estimar su concentración
mediante un análisis comparativo con patrones de concentración conocida. Los colorantes
fluorescentes actúan mediante inserción entre las pares de bases que conforman el ácido
nucleico. El bromuro de etidio es ampliamente utilizado para la visualización de ADN y ARN. Sin
embargo, éste es un reactivo altamente tóxico, con propiedades mutagénicas, por lo que debe ser
manejado con extremo cuidado en el laboratorio. En la actualidad existen colorantes fluorescentes
alternativos, como SYBR Safe, SYBR Gold, SYBR Green I, Vistra Green y Syto60, desarrollados
específicamente para reducir los riesgos potenciales de mutagénesis.
Objetivo
Realizar una electroforesis de agarosa del DNA extraído en las prácticas anteriores con el fin de
verificar su integridad.
Materiales
Molde para realizar geles
Cubeta electroforética horizontal
Fuente de poder
Matraz erlenmeyer de 250ml
Peine para pozos de electroforesis
Microondas
Agarosa
Fotodocumentador UV
Micropipetas
Muestras de ADN
Solución de bromuro de etidio
Guantes
Buffer de carga 6x (azul de
bromofenol (0.25%), xilencianol,
glicerol)
Buffer TAE 1X
Procedimiento
1. Se preparó de un minigel de agarosa al 1% (p/v) (0.30 g) en 30 ml de buffer TAE 1X
2. Se enfrió hasta que se pudiera tocar, se vertió la solución caliente en una cubeta
electroforética debidamente preparada y colocó el formador de pocillos (peine) en la
posición adecuada.
3. Se dejó gelificar la agarosa (aproximadamente 20 minutos a temperatura ambiente).
4. Se sumergió el gel en la cámara de electroforesis. Se añadió el buffer de electroforesis TAE
1X, de modo que rebasó el gel aproximadamente 1mm.
5. Se cargaron las muestras de DNA en cada pocillo colocando 4ul de buffer carga + 10ul de
muestra. Además en el primer pocillo del peine se incluyo un marcador de peso molecular
(4ul de marcador de DNA). El gel se dejó correr aproximadamente 30 minutos a 100 volts.
6. Se retiró el gel de la cámara electroforética y procedió a la tinción.
7. Se dejó reposar el gel en una solución con bromuro de etidio (0.5ug/ml) por 2 minutos,
teniendo extrema precaución.
8. Se realizaron lavados con agua destilada.
9. Se observó el gel a la luz UV en un fotodocumentador.
Resultados
M
M: Marcados molecular
1: ADN de una muestra de saliva extraído con
el buffer de lisis.
2: ADN de una muestra de sangre extraído
con el sistema comercial Paxgene.
3: ADN de una muestra de saliva extraído con
el método de fenol-cloroformo.
Se obtuvieron bandas de las muestras 1 y 2,
pero no hubo resultados de la muestra 3.
1
2
3
Discusión y conclusiones
Se obtuvo una banda
...