Practica 8. “ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS.

Biología molecular

Practica 9. “ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS”

Competencia: Conoce y aplica un método desnaturalizante para la extracción de proteínas de raspados de la mucosa oral y muestras sanguíneas.

Marco de referencia:

 La electroforesis constituye parte importante del procedimiento rutinario del análisis de los ácidos nucleicos y proteínas. Y así como el microscopio permite visualizar microorganismos y estructuras similares, la electroforesis nos ayuda a observar los ácidos nucleicos y proteínas al final del procedimiento. El principio básico de la electroforesis consiste en la migración de las moléculas a través de un gel u otro tipo de matriz de naturaleza porosa, en el cual, por acción de un campo eléctrico, serán separadas de acuerdo a su tamaño o peso molecular. Para controlar el avance de la separación de las moléculas en la matriz y establecer un patrón de fragmentos, las moléculas deberán ser teñidas con diferentes colorantes. Estos pasos facilitan la visualización de las moléculas a manera de simples bandas las cuales serán posteriormente analizadas e interpretadas. En biología molecular, la mayoría de los estudios básicos y aplicados requieren el uso de la electroforesis; sin embargo, este procedimiento presenta variaciones de acuerdo al tipo de estudio que se piensa ejecutar. En la electroforesis de tipo vertical, se analizan tanto moléculas de ADN como proteínas, mientras que en la electroforesis horizontal generalmente se trabaja con ADN o ARN. De otro lado, existen otros métodos electroforéticos que presentan ciertas modificaciones, así tenemos la electroforesis en campo pulsado, mayormente usada para separar fragmentos muy grandes de ADN (ADN genómico), la electroforesis bidimensional para un análisis más sofisticado de las proteínas etc.

Material y métodos:

- Tubo eppendorf de 1. 5 ml

-Puntas amarillas para pipetas de 20-20 µl

-Pipetas automáticas de 20-200 µl

-Centrifugar eppendorf

-Buffer RIPAA

- Piseta con agua bidestilada

-Diferentes muestras de raspados celulares y fluidos corporales

-Buffer PBS estéril

Procedimiento:

Previos

1.-Limpie la mesa de trabajo con solución de Benzal o hipoclorito de sodio.

2.-Coloque las muestras en hielo para evitar cualquier degradación.

3.-Tenga todo lo necesario a la mano y trabaje siempre con bata y guantes.

Técnica

Maneje cada muestra como sigue:

1. Muestra de sangre: separe el paquete globular del plasma y coloque 20 µl de cada una en un tubo eppendorf de 1.5 ml.
2. Raspado de la mucosa oral: enjuague el isopo en un tubo eppendorf con 1 ml de PBS. Centrifugar 5 minutos a 9,000 rpm. Elimine el PBS y guarde el paquete celular.
3. Semen: Coloque 20 µ de semen en un tubo eppendorf de 1.5 m.
4. Orina: Centrifugar 1 ml de orina a 10,000 rpm. Elimine el sobrenadante y guarde el sedimento.
5. Células de descamación: enjuague el isopo en un tubo eppendorf con 1 ml de PBS centrifugue 5 minutos a 9,000 rpm. Elimine el PBS y guarde el paquete celular.

  4.-Adicione 30 µl RIPA a cada muestra y disgregue con la plantilla.

5.- Mezcle vigorosamente con el vortex 2 minutos y coloque el tubo en hielo durante 10                            minutos.

6.-Centrifugar 10 minutos a 13,000 rpm.

7.-Guarde en hielo el sobrenadante que corresponde a fracción de proteína y elimine el sedimento.

Medidas de bioseguridad:

Algunos reactivos utilizados en los procedimientos descritos en esta práctica tienen la característica de ser tóxicos, irritantes, corrosivos, cancerígenos, mutagénicos y neurotóxicos, por lo tanto el investigador siempre deberá usar guantes, mascarillas, lentes protectores y mandil para evitar un contacto directo o accidental con ellos (Ver más adelante lista de estos reactivos).

...